作为一种重要的人兽共患病原菌,猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)不仅给全球养猪业造成巨大的经济损失,还严重危害公众健康。猪链球菌感染猪会导致脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎,甚至急性死亡;其感染人会导致脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征等。根据荚膜多糖抗原的差异,猪链球菌可以分为33个血清型。其中血清2型是世界范围内致病性最强,临床分离率最高的血清型。截止到2012年,人感染猪链球菌病例总数接近1600例,是2009年数据的两倍。尤其是1998年和2005年,中国江苏和四川分别暴发大规模猪链球菌疫情,不仅造成大量猪死亡,也导致多人感染和死亡。此外,猪链球菌还被鉴定为越南成人脑膜炎的第一大致病因,泰国的第二大致病因,香港社区获得性细菌脑膜炎的第三大致病因。在感染宿主过程中,猪链球菌会遭遇各种不利条件,因此需要转录调控系统来感知和应答环境信号。目前,一些双组分调控系统和一般调节因子已经被证实调控猪链球菌的环境适应性和致病性。Spx蛋白是一类全局性调节因子,在低GC含量的革兰氏阳性菌中高度保守。Spx被报道调控多种细菌的应激反应和毒力,但其在猪链球菌中的作用仍然未知。因此,本课题探讨了猪链球菌2型Spx调节因子的功能,发现Spx调节因子调控猪链球菌2型的应激反应和致病性。在此基础上,筛选4个受Spx A1调控的基因(0350、nox、tpx和cop A),探讨其在猪链球菌2型氧化应激反应和毒力中的作用,发现NADH氧化酶影响猪链球菌2型的抗氧化应激能力和致病性。具体研究内容如下:1.猪链球菌2型Spx调节因子的功能研究在猪链球菌2型中鉴定了两个Spx调节因子,分别命名为Spx A1和Spx A2。多序列比对结果显示猪链球菌的Spx蛋白与其它细菌的Spx调节因子具有极高的同源性,推测Spx在猪链球菌中具有重要功能。用同源重组的方法构建了两个调节因子的基因缺失突变株?spx A1和?spx A2。通过比较突变株和野生株在不同应激条件下的生长曲线,研究Spx调节因子在猪链球菌2型应激反应中的作用。发现Spx A1影响猪链球菌2型的氧化应激反应;Spx A2影响猪链球菌2型的氯化钠和SDS应激反应;两个Spx调节因子均影响猪链球菌2型的营养代谢。用小鼠感染模型评估突变株和野生株的致病性,证实两个Spx调节因子调控猪链球菌2型的组织定植和诱导小鼠产生炎性因子的能力。全基因组表达谱芯片结果显示,分布于多个功能类别的大量基因在突变株中差异表达,说明Spx调节因子发挥全局性调控作用。2.NADH氧化酶影响猪链球菌2型的氧化应激反应和致病性基于基因芯片数据,结合文献查阅,筛选4个在?spx A1突变株中显著下调的基因,探讨其在猪链球菌2型氧化应激反应和毒力中的作用。通过同源重组的方法构建4个基因的缺失突变株。比较突变株和野生株在正常培养和氧化应激条件下的生长曲线,初步研究4个基因在氧化应激反应中的作用;用小鼠感染模型评估突变株和野生株的毒力。结果显示NADH氧化酶影响猪链球菌2型的抗氧化应激能力和毒力。小鼠组织载菌量和炎性因子分析,以及仔猪感染实验进一步证实NADH氧化酶影响猪链球菌2型的致病性。通过定点突变构建NADH氧化酶的无活性突变体,证实NADH氧化酶的酶活在猪链球菌2型的氧化应激反应中发挥着重要作用,在致病性方面发挥着相对次要的作用。在?spx A1突变株中超表达NADH氧化酶能提高其抗氧化应激能力和毒力,说明NADH氧化酶影响Spx A1对猪链球菌2型氧化应激反应和毒力的调控作用。