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卵巢上皮性癌是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤,大多数病人临床表现为腹腔内播散和远处转移,由于目前尚缺乏对其发生发展确切分子机制的了解,严重阻碍了有效预防的发展。同源异型盒基因HOXB7是新近发现的转录因子。近年来的研究表明,它在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。但其与卵巢癌发生发展的关系以及对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究尚少。本课题从研究HOXB7基因在正常卵巢、良性卵巢浆液性囊腺瘤、交界性卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌组织和卵巢癌细胞株中的表达入手,利用RNA干扰(siRNA)技术抑制了卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3中HOXB7基因的表达,并运用Western blot、RT-PCR、免疫组化、流式细胞仪、明胶酶谱、趋向运动实验、Matrigel体外侵袭实验等探讨它在体外卵巢癌细胞增生、凋亡和侵袭过程中的作用。本课题共分三部分:①HOXB7基因在卵巢癌组织中的表达;②HOXB7基因对卵巢癌细胞增生、凋亡的影响;③HOXB7基因对卵巢癌细胞运动、侵袭能力的影响。第一部分HOXB7基因在卵巢癌组织中的表达目的检测HOXB7基因在正常卵巢、良性卵巢浆液性囊腺瘤、交界性卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌组织中的表达,探讨它与卵巢癌发生、发展的关系。方法应用Western blot方法检测正常卵巢(包括卵巢表面上皮及其下间质)、卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌组织中HOXB7蛋白的表达。应用免疫组织化学方法检测良性卵巢浆液性囊腺瘤、交界性卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌组织标本中HOXB7蛋白的表达。结果(1)与正常卵巢组织相比较,HOXB7蛋白的表达水平在卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌中显著升高(均为P<0.05)。(2)HOXB7蛋白在卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌中的表达显著高于良性卵巢浆液性囊腺瘤、交界性卵巢浆液性囊腺瘤(均为P<0.05)。(3)HOXB7基因的表达与卵巢浆液性囊腺癌、卵巢透明细胞癌临床分期及卵巢浆液性囊腺癌的病理分级呈正相关。结论与正常卵巢组织、良性、交界性卵巢肿瘤相比,卵巢癌中HOXB7基因的表达显著增高,且与卵巢癌的分级、分期呈正相关。提示HOXB7基因可能与卵巢癌的发展有关。第二部分HOXB7基因对卵巢癌细胞增生、凋亡的影响目的探讨同源异型盒基因HOXB7对卵巢癌细胞增生、凋亡的影响及影响卵巢癌增生的相关机制。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法检测人卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3中HOXB7mRNA及相应蛋白质的表达。针对HOXB7基因的mRNA序列设计了三条HOXB7特异性的siRNAs和一条阴性对照non-target siRNA,并分别克隆入pRNAT质粒载体,将重组质粒转入ES-2、SKOV3细胞,荧光显微镜下检测转染效率,半定量RT-PCR和Western blot方法检测干扰效果,并筛选出最有效的HOXB7siRNA进行后续试验。将ES-2、SKOV3细胞各分为三组:未转染组、转染阴性质粒pRNAT-neg组、转染干扰质粒pRNAT-hoxb组。BrdU实验和流式细胞仪分别检测各组细胞增生、凋亡的变化,并用Western blot方法检测与细胞增生密切相关的cyclin D1、cyclin E蛋白的表达变化。结果(1)HOXB7mRNA及蛋白在卵巢透明细胞癌ES-2细胞和卵巢浆液性囊腺癌SKOV3细胞中均呈阳性表达。(2)与转染阴性质粒的同种细胞相比,干扰质粒pRNAT-hoxb2和pRNAT-hoxb3特异并有效的抑制了ES-2和SKOV3细胞中HOXB7基因的表达,HOXB7mRNA的抑制率分别为:ES-2细胞,(83.95±2.14)%和(50.62±4.60)%、SKOV3细胞,(80.93±2.88)%和(59.18±3.87)%,(均P<0.05);HOXB7蛋白的抑制率分别为:ES-2细胞,(83.95±0.16)%和(46.47±2.29)%、SKOV3细胞,(71.25±0.86)%和(51.90±3.07)%,(均P<0.05)。干扰质粒pRNAT-hoxb2抑制率更高,故用于后续试验。(3)与阴性对照组相比,干扰HOXB7基因后,ES-2和SKOV3细胞的增生能力下降,各组细胞的增殖率分别为:ES-2细胞,未转染组(50.13±3.19)%、转染阴性质粒pRNAT-neg组(47.77±2.90)%、转染干扰质粒pRNAT-hoxb2组(28.31±2.88)%;SKOV3细胞,未转染组(35.40±1.95)%、转染阴性质粒pRNAT-neg组(33.13±2.19)%、转染干扰质粒pRNAT-hoxb2组(22.78±2.08)%,(均P<0.05)。(4)HOXB7 siRNA作用后,使卵巢癌细胞ES-2、SKOV3的周期阻滞在G1期,且细胞周期相关蛋白cyclin D1和cyclin E的表达下降。(6)HOXB7 siRNA作用后,可增加卵巢癌ES-2、SKOV3细胞的凋亡率。结论HOXB7siRNA可有效抑制卵巢癌ES-2和SKOV3细胞中HOXB7基因的表达,同时伴细胞增生能力下降,其机制可能与转录下调细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达,使细胞周期阻滞在G1期有关;干扰HOXB7基因的表达可促进ES-2和SKOV3细胞的凋亡。第三部分HOXB7基因对卵巢癌细胞运动、侵袭能力的影响目的探讨同源异型盒基因HOXB7对卵巢癌细胞运动、侵袭能力的影响及相关机制。方法选择具有高转移性的卵巢透明细胞癌细胞株ES-2作为研究对象。将ES-2细胞分为三组:未转染组、阴性对照组(转染阴性质粒pRNAT-neg)、干扰组(转染干扰质粒pRNAT-hoxb2)。把干扰质粒pRNAT-hoxb2和阴性对照质粒pRNAT-neg(构建见第二部分)分别转染入ES-2细胞,G418筛选稳定并有效表达pRNAT-hoxb2和pRNAT-neg的克隆。RT-PCR、Western blot方法检测稳定表达克隆中HOXB7的干扰效果;倒置显微镜观察干扰后细胞形态变化;趋向运动试验、Matrigel体外侵袭实验、明胶酶谱以及Western blot等方法观察三组细胞运动、侵袭能力及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、SNAIL基因表达水平的改变。结果(1)干扰组细胞中HOXB7mRNA和蛋白的表达明显低于未转染组和阴性对照组,(P<0.05)。(2)转染干扰质粒pRNAT-hoxb2后,ES-2细胞胞质突起变短,与未转染组和阴性对照组相比,干扰组细胞的趋向运动和侵袭能力明显下降(P<0.01)。(3)与未转染组和阴性对照组相比,干扰组细胞MMP-2的蛋白表达水平及活性降低,E-cadherin的表达升高,而SNAIL基因的表达降低,(均为P<0.05)。结论HOXB7siRNA可以降低卵巢癌ES-2细胞的运动和侵袭能力,可能与上调E-钙粘蛋白的表达及下调MMP-2、SNAIL的表达有关。提示HOXB7基因能促进卵巢癌细胞的运动和侵袭,它的异常表达可能在卵巢癌的浸润转移中起重要作用。本研究表明,同源异型盒转录因子HOXB7在卵巢癌组织中过表达,与卵巢癌病理分级、临床分期有关。干扰HOXB7基因的表达对体外卵巢癌细胞的增生,运动和侵袭能力均有一定的抑制作用,而对其凋亡有促进作用。本研究还检测了HOXB7基因在调节卵巢癌细胞增生和侵袭过程中所引起基因组分的变化,初步探讨了HOXB7基因调节卵巢癌增生和侵袭的可能的机制,为进一步研究卵巢癌的发病机制提供了新的思路。