目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）,以其发现者（Alois Alzheimer）命名的,是一种主要影响老年人的神经退行性疾病,其特点是逐步恶化的记忆、认知和行为,是世界范围内造成痴呆的主要原因,据估计,到2050年将有1.154亿人罹患AD。β-淀粉样肽（β-amyloid,Aβ）沉积是大多数学者认可的AD发病机制之一。Aβ通过引起线粒体功能损伤,引起氧化应激反应和钙离子超载,导致细胞色素C的释放和半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶的活化,从而启动神经元的凋亡。鹰嘴豆芽素A（Biochanin A）,是甲基化的天然异黄酮类化合物,属于植物雌激素,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等性质。研究显示,鹰嘴豆芽素A对单方面注入脂多糖诱导的帕金森大鼠模型具有保护作用,在脑缺血再灌注模型中具有神经保护作用,然而鹰嘴豆芽素A对AD模型中神经损伤的保护作用研究较少,机制尚不明确。本研究采用Aβ活性片断Aβ_25-35建立AD细胞模型、AD大鼠模型,检测Biochanin A对AD模型下的神经元及大鼠的保护作用,并进一步探讨Biochanin A神经保护作用的机制。方法:1大鼠大脑皮质原代神经元培养取新生24h内SD大鼠,无菌条件下取脑皮质部分,经胰酶消化成单细胞悬液,过滤后接种于用多聚赖氨酸预先包被的培养板中,置于5%CO₂及饱和湿度的37℃恒温细胞培养箱中培养,4 h后首次换液为含2%B27的neurobasal完全培养基,培养48 h后半量换液为含有阿糖胞苷的neurobasal完全培养基,48 h后完全换液去除阿糖胞苷,以后每隔2d半量换液。神经元培养七天即可用于实验。2 AD大鼠模型的制备大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后,将其固定于脑立体定位仪,沿颅骨中线切开皮肤,暴露出前囟位置。参考图谱中所描述的海马CA1区位置,根据动物实际大小稍作调整,距前囟向后3.5 mm,距中线左右各2.0 mm处,开直径为1 mm的骨窗,微量注射器垂直颅骨表面进针3.5 mm,缓慢注入5μL Aβ_25-35溶液,留针10 min,缓慢撤针,缝合。3凝聚态Aβ_25-35的制备在无菌条件下将2mg Aβ_25-35粉末溶解于1 ml灭菌注射用水中,分装后在37℃放置72 h使其老化后,将其储存于-20℃冰箱中备用。4实验分组与给药4.1 Aβ_25-35损伤大鼠神经元细胞模型的制备新生1d内的SD大鼠,取皮层部位进行体外培养,培养至神经元成熟以后（7d）,经Aβ_25-35处理,随机分为control组、Aβ_25-35组(Aβ_25-35浓度分别为10、20、40μM),处理24 h,检测细胞的存活率。4.2鹰嘴豆芽素A对神经元存活率的影响新生1d内SD乳鼠,取皮层部位进行体外培养,培养至神经元成熟以后,经Biochanin A处理,随机分为control组、Biochanin A组（Biochanin A浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、20μM）,处理24 h,检测细胞的存活率。4.3鹰嘴豆芽素A对Aβ_25-35所致神经元损伤的影响培养7d的皮层神经元,随机分组后分别加入不同浓度Biochanin A（0.2、1、5、10μM）与Aβ_25-35（20μM）,Biochanin A加入6 h后加入Aβ_25-35,处理24 h,MTT法检测细胞活性。4.4 Aβ_25-35对SD大鼠行为学的影响将30只体重180-200g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠随机分为3组(假手术组、溶剂对照组（假手术+蒸馏水）、以及Aβ_25-35损伤组),每组10只。术后7d-12d进行Morris水迷宫行为学测试。4.5鹰嘴豆芽素A对Aβ_25-35损伤大鼠行为学的影响将70只体重180-200g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠随机分为7组:假手术组、模型组、溶剂对照组、低浓度组（模型组+10mg/kg）、中浓度组（模型组+20mg/kg）、高浓度组（模型组+40mg/kg）、雌二醇对照组（模型组+雌二醇）。模型制备方法同第一部分,Biochanin A保护组于术后2周腹腔注射不同剂量的Biochanin A。溶剂对照组大鼠注射与高浓度组等体积的DMSO。Biochanin A注射2周后进行行为学测试。4.6雌激素受体抑制剂对鹰嘴豆芽素A的神经保护作用的影响取培养7d的神经元细胞,随机分为control组、Aβ_25-35（20μM）组、Biochanin A保护组(20μM Aβ_25-35+1μM Biochanin A)、雌激素受体抑制剂阻断Biochanin A组(20μM Aβ_25-35+1μM Biochanin A+10μM ICI182780)、E2保护组(20μM Aβ_25-35+100 n M E2)、雌激素受体抑制剂阻断E2组(20μM Aβ_25-35+100 n M E2+10μM ICI182780)。采用Western blot法观察雌激素受体抑制剂（ICI182780）干预Biochanin A对Aβ_25-35诱导的神经元caspase-3表达水平的影响。4.7鹰嘴豆芽素A对神经元内MAPK家族蛋白的影响取培养7d的神经元细胞,随机分为control组、Aβ_25-35（20μM）组、Biochanin A保护组(20μM Aβ_25-35+1μM Biochanin A)。采用Western blot法观察Biochanin A对Aβ_25-35诱导的神经元MAPK家族蛋白表达水平的影响。4.8鹰嘴豆芽素A及p38 MAPK抑制剂SB202190对凋亡蛋白家族的caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78及p38通路的影响取培养7d的神经元细胞,随机分为control组、Aβ_25-35（20μM）组、Biochanin A保护组(20μM Aβ_25-35+1μM Biochanin A)、p38 MAPK抑制剂阻断组(20μM Aβ_25-35+10μM SB202190)、p38 MAPK抑制剂组（10μM SB202190）、雌二醇保护组(20μM Aβ_25-35+100 n M E2)。采用Western blot法观察p38 MAPK抑制剂（SB202190）对Aβ_25-35诱导的神经元caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78、P-p38、ATF2表达水平的影响。5 MTT法检测细胞存活率细胞接种于24孔板,加药处理24 h后,每孔加入20μL MTT液(3.6mmol·L^-1),37℃孵育4 h,弃上清,加入500μL DMSO,使甲瓒结晶溶解。酶标仪测定570 nm处的吸光度值,每组设6个复孔。6 Western Blot分析取分组加药处理后神经元细胞,冰上操作,提取细胞蛋白,蛋白提取液与上样缓冲液混合,煮沸变性。SDS-PAGE电泳使蛋白样品分离,100m A恒流转膜,脱脂奶粉室温封闭2 h以上,一抗4℃过夜,TBST漂洗30min后加二抗室温孵育2 h,TBST漂洗30 min,暗盒中加ECL发光试剂显色,暗室中压X光片显影。X-光胶片经扫描,应用Image J图像分析软件对扫描图上的条带进行相对定量分析。7 Morris水迷宫行为学测试提前1 h将SD大鼠放置于行为学测试房间内,使其适应环境。行为学测试于每天9:30开始,室温25℃,水温20℃-22℃,Morris水迷宫行为学测试历时6天,前5天进行定位航行实验,每天训练4次。大鼠入水至寻找到平台所需时间为逃避潜伏期（escape latency）。第6天为空间探索实验,撤去平台,将大鼠从与平台所在象限相对的象限面壁放入水中,记录大鼠90 s内穿越平台区的次数（number of platform crossings）以及大鼠在平台所属象限（第一象限）停留的时间百分比（Ⅰtime ratio）等行为学指标。8数据处理上述实验均重复三次,所有数据都以均数±标准差（mean±SD）表示,数据经SPSS 13.0统计软件处理,采用单因素方差分析（one way ANOVA）继以student’s t test对数据进行统计分析。结果以P<0.05视为差异有统计学意义。结果:1 Biochanin A对Aβ_25-35所致原代培养皮质神经元损伤的作用1.1 Aβ_25-35建立AD细胞模型MTT法检测结果显示,与溶剂对照组相比,10、20、40μmol/L Aβ_25-35作用于大鼠皮质神经元24 h后均可致神经元细胞的存活率降低,而20μM Aβ_25-35作用24 h后,细胞的存活率为溶剂对照组的（62.55±0.01）%（P<0.05）在上述浓度范围内,根据Aβ_25-35的毒性,选择20μmol/L Aβ_25-35处理24 h建立AD细胞模型。1.2 Biochanin A对神经元存活率的影响MTT法检测结果显示,与溶剂对照组相比,0.5、1、2.5、5、10、20μmol/L的鹰嘴豆芽素A作用于大鼠皮质神经元24 h后细胞存活率没有明显变化。1.3 Biochanin A对Aβ_25-35所致神经元损伤的作用MTT法检测结果显示,与对照组相比,1μmol/L鹰嘴豆芽素A对Aβ_25-35处理24 h后,显示出最大的保护作用,其存活率为Aβ_25-35损伤组组的125.8%（P<0.05）。2 Biochanin A对AD大鼠模型的影响2.1 Aβ_25-35对大鼠空间学习记忆能力的影响7 Morris水迷宫行为学测试Morris水迷宫测试结果显示,定位航行实验期间每一组大鼠的逃避潜伏期全部随学习天数的逐渐增加而缩短;三组大鼠每天平均游泳速度无统计学差异;相比于溶剂对照组大鼠,模型组大鼠逃避潜伏期显著增加（P<0.05）,而假手术组大鼠的学习成绩与溶剂对照组大鼠无统计学差异。空间探索实验期间假手术组大鼠穿越平台区的次数与溶剂对照组大鼠无统计学差异,假手术组大鼠与溶剂对照组大鼠在平台所在象限停留时间百分比无统计学差异。与溶剂对照组相比,Aβ_25-35组大鼠穿越平台区的次数显著减少（P<0.05）。与溶剂对照组相比,Aβ_25-35组大鼠在平台所在象限停留时间百分比显著减少（P<0.05）。2.2 Biochanin A对Aβ_25-35损伤大鼠空间学习记忆的影响Morris水迷宫行为学测试结果显示,定位航行实验期间各组大鼠的逃避潜伏期全部随学习天数的增加而逐渐缩短;七组大鼠每天平均游速无统计学差异;相比于溶剂对照组,雌二醇组部分逆转Aβ_25-35损伤引起的逃避潜伏期增加,鹰嘴豆芽素A能够改善Aβ_25-35损伤引起的逃避潜伏期增加,且作用呈浓度依赖性。空间探索实验结果显示,鹰嘴豆芽素A能够改善Aβ_25-35损伤大鼠平台区穿越次数减少及在平台所在象限停留时间百分比减少的现象,且作用呈浓度依赖性。3雌激素受体抑制剂对Biochanin A的神经保护作用的影响Western blot结果显示,与鹰嘴豆芽素A保护组(20μM Aβ_25-35+1μM Biochanin A)相比ICI182780处理组(20μM Aβ_25-35+1μM Biochanin A+ICI182780)caspase-3蛋白水平明显增加（P<0.05）。4 Biochanin A对神经元内MAPK家族蛋白的影响Western blot结果显示,与control组相比Aβ_25-35损伤组P-JNK、P-p38的表达增加,P-ERK的表达降低（P<0.05）。与Aβ_25-35损伤组相比,鹰嘴豆芽素A保护组P-p38蛋白水平降低（P<0.05）,而P-JNK、P-ERK没有明显变化。5 Biochanin A及p38 MAPK抑制剂SB202190对凋亡蛋白家族的caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78以及p38信号通路的影响Western blot结果显示,与Aβ_25-35损伤组相比,鹰嘴豆芽素A保护组与p38 MAPK抑制剂处理组caspase-3蛋白水平明显降低（P<0.05）。与Aβ_25-35损伤组相比,鹰嘴豆芽素A保护组与p38 MAPK抑制剂处理组Bax/Bcl-2比值明显降低（P<0.05）。Western blot结果显示,与Aβ_25-35组相比,鹰嘴豆芽素A组与p38MAPK抑制剂处理组P-p38、ATF2蛋白水平明显降低（P<0.05）。与control组相比,Aβ_25-35损伤组grp78蛋白水平明显升高（P<0.05）。鹰嘴豆芽素A保护组能明显抑制Aβ_25-35引起的grp78蛋白水平升高（P<0.05）。Aβ_25-35+SB202190组与单加SB202190组grp78蛋白水平与Aβ_25-35组相比没有明显降低。结论:1 Biochanin A能对抗Aβ_25-35诱导的神经元损伤,对Aβ_25-35损伤大鼠空间学习记忆具有改善作用。2 Biochanin A能对抗Aβ_25-35诱导的神经元损伤的作用可能是通过与雌激素受体结合完成的。3 Biochanin A可能通过线粒体凋亡途径、p38 MAPK信号通路抑制Aβ_25-35诱导产生的神经损伤作用,并且可能通过非依赖性p38 MAPK调控内质网应激而产生神经保护作用。