脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一,具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。其中缺血性脑血管病(Ischemic Cerebral Vascular Disease,ICVD)在世界范围内约占脑血管病的55%～80%,其发病率约是出血性脑血管疾病的3倍。因此,有效地防治缺血性脑血管病一直是医学领域的重要研究课题之一。现代医学对于本病的治疗主要为溶栓及神经元保护两个方面。但迄今仍无公认的具有显著临床疗效的药物,这就迫使我们在缺血性脑血管病的治疗中寻找新出路。随着人们应用中医药对缺血性脑病治疗的不断探索,近年来的研究重点立足于神经血管单元的概念,通过保护血管内皮细胞来减轻脑组织损伤。基于中医络病理论研发的通心络在基础与临床研究中都具有保护缺血区微血管完整性等作用,为脑缺血治疗开辟了一个新途径。而现代研究已发现脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMEC)的旁分泌功能对神经元的存活有重要调节作用,不同脑微血管内皮细胞条件培养液中的差异蛋白可能是实现其调节作用的物质基础,如胎盘生长因子(Placenta growthfactor,PLGF)对缺氧缺糖神经元有明显的保护作用。本研究以PLGF为切入点,分别从整体和离体研究探讨脑缺血缺氧后在通心络作用下PLGF在脑微血管内皮细胞和脑组织分泌表达的规律及其保护神经元的分子生物学机制,为通心络治疗缺血性脑病提供科学依据。研究目标本研究在"营卫交会、由络以通"理论指导下,以PLGF为切入点,观察通心络对实验性大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及PLGF表达的影响;探讨脑缺血状态下脑微血管内皮细胞条件液对神经元活性及PLGF含量的影响,进而揭示PLGF保护神经元的分子生物学机制及内皮细胞介导的脑损伤保护环节,围绕神经血管单元探讨通心络干预脑梗死的作用机制,揭示既往提出的"缺血区微血管保护—脑梗死治疗新靶点"的科学内涵,对于指导治疗脑血管疾病的中医药现代化研究具有重要启示。研究方法和内容1.线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞的脑缺血模型。实验动物随机分为假手术组、模型组、通心络组、丁苯酞组(阳性对照药),存活期为1d、3d。各组动物在手术清醒后、术后1d、3d及取材前分别进行神经功能评分,分数越高损伤越重,前后两者比值表示神经功能恢复情况;采用HE染色观察脑组织的病理变化;免疫荧光技术检测MAP-2的表达以观察神经元的变化,确证通心络的疗效和对神经元的保护作用。2.动物分组及存活期同上。免疫组化法检测脑组织中PLGF表达,免疫荧光双标方法(PLGF+CD31、PLGF+MAP-2)分析PLGF在脑血管内皮细胞和神经元的表达规律;酶联免疫吸附法(Elisa法)检测大鼠脑组织匀浆及血清中PLGF的含量,探索脑缺血损伤大鼠脑组织中的PLGF表达部位及细胞类型。3.原代培养脑微血管内皮细胞,采用CCK-8法观察不同浓度通心络含药血清在作用不同时间后对脑微血管内皮细胞活性的影响以确定其给药的最佳浓度和时间。建立体外脑微血管内皮细胞氧糖剥夺模型,采用CCK-8法观察通心络含药血清对体外缺血损伤内皮细胞活性的影响;利用硝酸银还原法检测其上清液中一氧化氮(nitric oxide,NO)、Elisa法检测血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、PLGF的含量,分析通心络对脑微血管内皮细胞功能及分泌PLGF的影响。4.原代培养大鼠皮层神经元,采用氧糖剥夺法建立体外神经元缺血模型。收集通心络含药血清干预下脑微血管内皮细胞不同条件液作用于培养的神经元,CCK-8法检测神经元存活率、WST法检测超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、脂质氧化检测法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化,以探索通心络可能通过调节内皮细胞的旁分泌功能保护神经元的机制。5.原代培养大鼠皮层神经元并建立体外神经元缺血模型。在MAPK信号通路阻断剂和PI-3K信号通路阻断剂作用下,CCK-8法检测PLGF干预前后神经元活性及存活率,Tunel法检测神经元凋亡,免疫蛋白印记法检测不同信号通路上相关蛋白Bax、Bcl2和p-ERK1/2的表达变化,进一步从细胞信号转导通路的角度探索PLGF在缺血状态下抑制神经元凋亡的分子生物学机制。结果1.整体实验部分(1)动物造模醒后各组神经功能评分无明显差异;给药后,各时间点通心络组与模型组相比评分降低;将取材前与造模醒后评分的比值进行分析,相对于1d模型组,通心络组的两次评分比值显著下降。相对于3d模型组,通心络组和阳性对照药组的两次评分比值显著下降。(2)HE染色结果显示假手术组脑组织结构完整,细胞排列整齐。模型组缺血侧脑组织皮层组织结构紊乱,神经元细胞核固缩、浓染,部分神经元消失。通心络组各时间点的脑组织病理变化均较模型组有不同程度的减轻,存活神经元数目有所增加,丁苯酞组皮层缺血区的损伤比通心络组严重。(3)假手术组脑组织MAP-2荧光强度高。模型组患侧皮层MAP-2的表达明显减少,尤以梗死区为甚,可见较大范围的弱荧光区;与模型组比较,通心络组大鼠患侧皮层的MAP-2荧光表达强度增加,丁苯酞荧光强度稍有增加。(4)Elisa结果显示PLGF在大鼠缺血脑损伤1d时血清中含量开始显著升高,3d含量更高,大鼠脑组织匀浆中PLGF的表达呈现相同的表达规律;通心络组PLGF在血清及匀浆中的表达均明显高于假手术组和模型组,并随时间延长而增高。(5)免疫组化结果显示PLGF主要表达在缺血半暗带和梗死中心的神经元、血管内皮细胞,脑缺血后血管内皮细胞表达显著增多。双重免疫荧光标记法显示正常状态下PLGF主要表达于神经元,而缺血状态下血管内皮细胞也大量表达PLGF。2.离体实验部分(1)通心络含药血清干预后,10%含药血清作用24h后BMEC活性明显提高即为通心络含药血清最佳浓度及作用时间。体外拟缺血模型组内皮细胞上清液中NO、vWF含量显著升高,而通心络含药血清可明显降低NO、vWF的水平。(2)正常内皮细胞条件培养液对正常神经元和拟缺血损伤神经元的活性无明显影响,但通心络含药血清干预的正常内皮细胞条件培养液对损伤的神经元有明显的保护作用;拟缺血损伤的内皮细胞条件液可使正常和损伤神经元的活性和SOD活力降低、MDA的产生增加,但通心络含药血清干预的拟缺血内皮细胞条件培养液可明显抑制这种降低,并使MDA的产生减少。拟缺血模型组的条件液中PLGF表达显著升高,经过通心络含药血清干预后PLGF较正常组有明显升高。(3)相对于正常对照组,拟缺血损伤神经元(OGD组神经元)的存活率显著下降,凋亡率显著升高,相关凋亡蛋白Bcl-2的表达明显减低而Bax显著升高;与模型组相比,PLGF干预后神经元存活率明显提高,凋亡率显著降低,Bcl-2明显升高而Bax显著降低;与OGD+PLGF组比,MAPK信号通路阻断剂PD98059组神经元存活率明显降低,凋亡率显著升高,Bcl-2明显减低而Bax显著升高,而PI-3K信号通路阻断剂LY294002组细胞存活率等均无明显差异。另一方面,OGD组可明显降低p-ERK1/2表达,PLGF干预后可提高拟缺血神经元p-ERK1/2的表达。结论1.通心络可以促进大鼠脑缺血后神经功能恢复、保护神经元及增加PLGF的表达和分泌量。正常状态下脑组织微血管内皮细胞仅释放少量PLGF,相反,受到缺血刺激而被激活的血管内皮细胞可释放大量的PLGF。故本研究证实了通心络对实验性大鼠局灶性脑缺血模型具有确切可靠的保护作用,并提出这种保护作用可能与PLGF相关。2.本研究首次观察到通心络干预下的脑微血管内皮细胞的旁分泌功能对拟缺血神经元的存活及氧化应激反应有重要的改善作用,并发现通心络干预的脑微血管内皮细胞分泌的PLGF在受到缺血缺氧刺激后会反应性升高。3.PLGF可以提高拟缺血神经元的存活率,本研究首次发现它可降低拟缺血神经元凋亡率及调节凋亡相关蛋白的表达,并发现这种作用与MAPK信号通路相关。总之,通心络治疗脑缺血的新靶点可能是以神经血管单元为核心改善微血管功能以介导脑神经保护的作用,而该作用可能与PLGF相关,PLGF可能通过MAPK信号通路发挥保护神经元的作用。