家蚕bmo-miR-7靶基因yan的鉴定

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miR-7和yan基因调控果蝇光感受器的分化和复眼的发育,它们相互负调控形成一个调控回路,保证果蝇复眼的正常发育。家蚕作为经典遗传学研究的模式生物之一,在复眼的发育中,是否存在和果蝇复眼发育一样的调控模式?要回答这一问题,就要先证明家蚕miR-7在yan基因上的识别位点。所以,本文对bmo-miR-7的靶基因Bmyan进行了初步研究。获得的主要研究结果如下:1、家蚕Bmyan基因的克隆和表达。Bmyan基因长为1431bp,编码477个氨基酸,由4个外显子和3个内含子构成。其蛋白含有SAM-PNT蛋白结构域和ETS蛋白结构域。在动物中,SAM-PNT蛋白结构域在信号传导中是广泛分布的一种结构域;ETS蛋白结构域是一种转录因子,其蛋白分子结合在基因组特异的DNA序列上,诱导或者抑制基因转录,其结构包含三个α-螺旋和四股β-层,组成一个螺旋-转角-螺旋结构,第三个α-螺旋负责与DNA的大沟结合。同源性分析结果表明,yan高度保守。基于RT-PCR检测,Bmyan在5龄3天的家蚕头部、卵巢中高量表达,体壁、中肠中次之,精巢和血液中微量表达,在其余组织中未检测到表达信号。在幼虫期,Bmyan表达水平相对较低,也没有大的波动,但在蛹期却高量表达。2、家蚕Bmyan基因3’UTR的克隆与序列分析克隆了Bmyan基因的3端非翻译区(3’UTR)。Bmvan基因的3’UTR长568bp,与Bmyan基因拼接后总长为1999bp。经RNAhvbrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)在线软件预测,该基因全长序列的1529-1546位点上有bmo-miR-7的一个靶位点。3、荧光素酶报告基因共转染bmo-miR-7 mimics验证靶基因构建含有Bmyan基因3’UTR和荧光素酶报告基因的转染载体,将该载体与bmo-miR-7的mimics序列共转染到家蚕胚胎细胞系BmE中,通过测定荧光素酶的活性,初步证实Bmyan基因的3’UTR上存在bmo-miR-7的识别位点。
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