原位杂交和间接原位PCR检测DPV方法的建立及应用于对DPV人工感染鸭后病毒分布规律检测的研究

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据Gene Bank有关鸭瘟病毒(DPV)的一个765bp的ECORI片段序列,应用Oligo软件设计的一对引物,经液相PCR扩增出了预期长度为498bp的片段;在此扩增片段范围内,应用Oligo软件设计长度为37bp的寡核苷酸探针,建立了能特异的从感染鸭组织石蜡切片中检测出鸭瘟病毒核酸的原位杂交和间接原位PCR方法。 应用建立的原位杂交检测DPV CHv强毒株人工感染不同时间在鸭体各组织器官的分布规律,结果表明:感染后4小时分别在肝脏、肠道、法氏囊中检测到DPV DNA,感染后6小时DPV DNA出现在脾脏、食道中,感染后12小时从胸腺中检测到DPV DNA。肺、肾脏中DPV DNA含量较少,仅在死亡鸭中检测到有少量DPV DNA分布。 应用间接原位PCR检测肝脏,人工感染后2h即可出现阳性反应。原位杂交与间接原位PCR检测肝组织表明,肝脏中主要的感染细胞有肝细胞,窦皮细胞,枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘。 应用原位杂交检测其它组织,结果表明,小肠中阳性信号主要分布于肠绒毛上皮细胞核内、胞浆内及肠绒毛的固有层中。但随着小肠病变越来越严重,肠绒毛断裂,信号有逐渐减弱的趋势。食道中阳性信号主要分布于棘层。在法氏囊中DPV DNA主要分布于上皮和皮髓质部。胸腺中DPV DNA多出现在髓质部,与法氏囊中的检测结果相比,胸腺中阳性信号较弱,仅有少许淋巴细胞呈阳性反应。在脾脏中阳性细胞为少许淋巴细胞和巨噬细胞。 本研究对建立的原位杂交方法和间接原位PCR方法检测肝脏进行了比较,结果表明:间接原位PCR比原位杂交早2小时从肝脏中检测到鸭瘟病毒DNA,另一方面,间接原位PCR与原位杂交平行检测肝脏组织时,间接原位PCR检测到阳性信号明显强于应用原位杂交的检测结果。
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