乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是对人类威胁最大的病毒之一。根据全基因组>8﹪的差异，HBV基因组分为A～H八个亚型。HBV基因型分布具有明显的地域特征。不同HBV基因型感染者具有不同的病情发展情况，对各种治疗药物的应答也不尽相同。因此，对HBV感染病人进行HBV基因分型具有重要的临床意义。目前已经有很多对HBV进行基因分型的方法，但是绝大部分相对来说都费时费力、成本较高，不利推广使用。更重要的是，一个碱基的突变就足以影响这些方法的检测结果。 反向斑点杂交方法(Reverse dot blot，RDB)是一种基于PCR基础之上的，并经过不断发展和完善的方法。反向斑点杂交可以区分有只一个碱基差异的序列，可以在装备一般的医院或实验室里进行。通过流过式杂交原理的结合使用，该方法变得更加准确和快速。 第一章反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的建立 目的：建立一种基于反向斑点杂交技术的检测HBV基因型的方法。该反向斑点杂交技术整合有最新的流过式杂交原理。所建立的方法对一个碱基突变不敏感。 方法：使用已知基因型的：HBV阳性标本建立反向斑点杂交检测的方法。通过分析Genebank上的序列来设计引物探针。摸索确定RDB方法的最佳反应条件。使用经过HBV定量试剂盒定量的临床标本来测定该方法的特异性和灵敏度。用广州来源的101例阳性标本的测定结果与多重PCR和测序方法进行比较。 结果：通过调整杂交温度，能使得反向斑点杂交对单碱基突变不敏感。所设计的探针理论上可以准确检出所有Genebank上已知的HBV序列。这些探针RDB的最佳杂交温度是45℃。标本检测表明，所有的HBV阴性的标本都得到了相应的阴性结果。该方法的检测灵敏度为10<3>～10<4>拷贝/ml。该方法与多重PCR相比有84﹪的一致性，与测序相比有96﹪的一致性。 结论：建立的反向斑点杂交检测HBV基因型的方法快速、可靠并且廉价。即使在一些没有特殊装备的医院里，该法亦可被用来进行临床样本的HBV分型检测。 第二章反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价 背景：HBV的DNA聚合酶缺乏校正功能，因而HBV基因组具有较高的突变率。在第一章中已经建立了反向斑点杂交检测HBV基因型的方法，该方法与其他方法比较有很好的一致性。但第一章的标本均来源于同一医院，地域差异不显著，并不能体现HBV高突变率对所建立方法的影响，也不能体现该方法临床适用的广泛性。 目的：评价所建立的反向斑点杂交检测HBV基因型方法临床适用的广泛性和准确性。 方法：用建立的反向斑点杂交检测HBV基因型的方法，检测来源于中国各省份不同医院的723例HBV阳性血清标本。选取其中的HBV基因型为单型且测序结果清晰可读的标本，用于比较RDB方法结果和标本测序之后用NCBI在线分型的结果，以及与测序后进行系统进化分析的结果。分析这些标本与所用探针的匹配情况，分析单碱基突变对RDB方法的影响程度。 结果：723例标本HBV基因型的检出率为97.6﹪。其中423例单型且测序结果清晰的标本，RDB与测序之后的系统进化分析结果完全一致。RDB与测序之后的NCBI在线分型结果一致性为98.8﹪(418/423)。之后分析这些标本序列与探针差异得知，与相应探针有1个碱基差异的标本B型12例、C型38例，D型l例被成功分型。该方法还准确检出了1例与C型探针差异一个碱基的A型标本，8例与A型探针差异一个碱基的C型标本。 结论：本研究所建立的方法能快速准确地对中国各省份来源的HBV进行分型。该方法有很强的临床适用性，与测序法比较一致性较高。该方法可以被应用于国内各大小医院的临床的HBV分型检测。 第三章反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的应用 背景：已经建立的反向斑点杂交技术检测HBV基因型的方法具有快速、简便、准确的特点。HBV基因型的分布具有明显的地域特征。不同HBV基因型感染病人病情发展不同，不同的HBV基因型感染病人发展为HCC、LC的风险也不同。但其分子机制的研究还鲜见报道。 目的：研究HBV基因型在中国的分布情况。研究HBV基因型与临床指标的关系，研究肝癌病人中HBV基因型与其临床指标的关系，以期找到HBV基因型引起HCC发生风险的分子机制的一些线索。 方法：用第二章的反向斑点杂交方法检测：HBV基因型。检测了706例分别来自中国各省份的HBV阳性血清，用于分析中国各地HBV基因型的分布情况。用卡方检验fisher精确概率法，分析145例有HBV阳性病人的HBV基因型与年龄、性别、HBeAb、HBeAg、HBV-DNA水平以及临床诊断之间的相关关系：分析58例肝癌患者HBV基因型与一些临床指标的关系。这些临床指标还包括一些肿瘤标记物。 结果：证实HBV在中国主要以B、c型分布为主。D型主要分布在新疆地区。145例HBV阳性病人的分析结果表明，HBV基因型分布与年龄、性别、HBeAb、HBeAg等临床指标的关联无统计学意义。但与HBV-DNA水平的关联有统计学意义，即不同HBV基因型的HBV-DNA的水平差异显著(p=0.000338)。58例HCC患者的研究结果表明，：HBV基因型与肿瘤包膜、病灶数量、肝炎史与否、浸润与否、血管侵入与否、饮酒史、肿瘤家族史、是否转移、临床分期、ALT水平、AST水平等临床指标的关联无统计学意义。也与肿瘤相关基因．AFP、CEA、CA125、CA19-9、Pokemon、HCCR、Caspase3、Suvivine、Midkine等表达的关联无统计学意义。但与吸烟史的关联有统计学意义，即HBV基因型在是否有吸烟史病人中的分布差异显著(P=0.0236)。 结论：中国主要以B、c分布为主。D型主要分布在中国的新疆地区。在145例HBV阳性病人血清中，不同HBV基因型的HBV-DNA的水平差异显著。在58例HCC患者中，HBV基因型在是否有吸烟史病人中的分布差异显著。说明HBV基因型和吸烟共同作用可能能提高HCC发病风险。