论文部分内容阅读
临床肿瘤放射治疗主要采用外照射治疗，但其会在射线杀伤肿瘤细胞的同时损伤周围正常细胞。因此，科学家一直在探索如何提高肿瘤放射治疗效果并同时降低射线对周围正常组织损伤的方法。1946年Na131I首次用于甲状腺癌治疗以来，负电子内照射治疗肿瘤已有60多年。就电离辐射损伤效应而言，正电子与负电子均可直接间接杀伤肿瘤细胞。近年来人们逐步开展正电子治疗肿瘤的研究工作，目前以18氟-氟代脱氧葡萄糖（18F-2-Deoxy-2-Fluoro-D-Glucose，18F-FDG）为代表的正电子放射性药物在临床上广泛用于PET显像。研究证实，短半衰期的18F衰变，发射正电子，在组织内射程0.1-0.2mm，通过湮没辐射产生γ射线，可进行PET显像，而且可以对高度摄取18F-FDG的恶性肿瘤进行放射治疗。我国是肝癌的高发地区。近年发病率呈缓慢上升趋势，病死率也随之上升，占癌症死亡率的第三位。肝癌的治疗方法非常多，但肝癌是各种实体肿瘤中预后最差的恶性肿瘤之一，接受治疗的肝癌病人5年生存率仅14％—30％，故有必要寻找新的肝癌治疗方法。由于肝癌原发灶及转移灶可以高度选择性地摄取18F-FDG，肿瘤恶性程度越高，细胞代谢越旺盛，对18F-FDG的摄取率就越高，治疗效果就越好。
目的：本课题从细胞受照后形态变化、细胞增殖、细胞凋亡、活性氧产量、相关基因表达等方面，探讨不同放射性活度18F-FDG对HepG2肝癌细胞的影响，探讨 18F-FDG抑制HepG2肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡的可能机制。为将来利用正电子放射性药物内照射治疗肝癌原发灶和转移灶提供实验依据。
方法：（1）细胞培养：将HepG2肝癌细胞接种于含10％小牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％CO2传代培养。(2)细胞照射：取对数生长期细胞，于传代24h后分别加入18F-FDG使其终放射性浓度0.925×107 Bq/mL、9.25×107 Bq/mL、92.5×107 Bq/mL，对照组仅加入等体积的DMEM完全培养基，照后24h分别进行实验。(3)细胞形态观察取各照射组及对照组细胞后，普通倒置显微镜观察细胞形态变化，照相。（4）MTT法测定细胞增殖：取对数生长期细胞，胰酶消化，调成细胞浓度为1×105/ml的悬液,接种于96孔板,每孔100ul，加100ul完全培养基，培养24h。照射组每孔加18F-FDG，使其活度浓度为实验设定浓度。空白孔加同体积培养基。加18F-FDG6、12、24h后每孔加20ul浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h后弃培养基,每孔加入DMSO150ul，震荡10min，在酶标仪上检测测各孔的OD值（波长570nm）。计算细胞增殖的抑制率。（5）细胞凋亡率的检测：以0.125％胰蛋白酶消化、培养液制成单细胞悬液，计数活细胞并调整细胞浓度5×105/ml。离心收集细胞，PBS洗涤，-20℃预冷的70％乙醇固定1h后，PBS洗涤，用5mg/mlRNA酶在37℃孵育30min，以10μg/ml碘化丙啶(Propidium iodide，PI)溶液染色，避光反应15min，流式细胞仪检测。（6）细胞内活性氧的测定：18F-FDG处理细胞6h后，PBS洗涤2次，分别加入150μl 20μmol/L DCFH-DA工作液，在CO2培养箱内37℃孵育30min，PBS洗涤3次后，以流式细胞仪在激发光波长485nm,发射光波长538nm处检测细胞荧光强度,每个样本计数10000个细胞，以WinMDI软件分析平均荧光强度(mean fluorescent intensity，MFI)。（7）RT-PCR检测P53基因,rad51基因表达：细胞加18F-FDG 24小时后，抽提总RNA：具体步骤见Trizol总RNA抽提试剂盒说明书。提取的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应。反应产物在凝胶中以100V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照,经Bandscan软件进行半定量分析,将测出各条带灰度值除以β-actin的灰度值,得到一相对强度(relative intensity ,RI),通过各浓度组的RI值比较可得出基因表达的变化规律。（8）统计学分析：所测数据用`x±s表示，采用SPSS(10.0)软件进行统计学处理，各组之间差异性比较采用两独立样本t检验，用直线回归分析数据变量间依存关系。
结果：（1）倒置显微镜观察到各实验组均出现典型的凋亡细胞，细胞体积变小、胞质浓缩、细胞核增大、甚至固缩、细胞破裂呈凋亡状态。随着18F-FDG增加，凋亡细胞密度明显增加。（2）加18F-FDG后6、12、24h，HepG2细胞的生长受到抑制，抑制率随着药物放射性浓度的增加及作用时间的延长显著的增加；（3）随着18F-FDG放射性浓度增加细胞凋亡率逐渐增加。 HepG2细胞凋亡率（％）分别为3.3±0.01，4.5±0.07，16.9±0.23（各组与对照组细胞凋亡率0.5±0.31比较，P<0.05）；（4）不同放射性浓度18F-FDG作用于HepG2细胞 6小时，受照细胞中活性氧含量均显著高于对照（p＜0.01），且随着18F-FDG放射性浓度增大，照射量增加，细胞中活性氧含量逐渐增加。（5）加不同放射性浓度18F-FDG24h后，P53基因，rad51基因，表达灰度值与内参β-actin灰度值之比RI随着18F-FDG浓度增加而增加。
结论：18F-FDG 能诱导HepG2细胞出现典型凋亡形态学变化，18F-FDG可通过发射的β+射线对HepG2细胞产生内照射，产生活性氧、造成Rad51基因过表达及促进P53基因表达，最终导致HepG2肝癌细胞凋亡。
目的：本课题从细胞受照后形态变化、细胞增殖、细胞凋亡、活性氧产量、相关基因表达等方面，探讨不同放射性活度18F-FDG对HepG2肝癌细胞的影响，探讨 18F-FDG抑制HepG2肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡的可能机制。为将来利用正电子放射性药物内照射治疗肝癌原发灶和转移灶提供实验依据。
方法：（1）细胞培养：将HepG2肝癌细胞接种于含10％小牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％CO2传代培养。(2)细胞照射：取对数生长期细胞，于传代24h后分别加入18F-FDG使其终放射性浓度0.925×107 Bq/mL、9.25×107 Bq/mL、92.5×107 Bq/mL，对照组仅加入等体积的DMEM完全培养基，照后24h分别进行实验。(3)细胞形态观察取各照射组及对照组细胞后，普通倒置显微镜观察细胞形态变化，照相。（4）MTT法测定细胞增殖：取对数生长期细胞，胰酶消化，调成细胞浓度为1×105/ml的悬液,接种于96孔板,每孔100ul，加100ul完全培养基，培养24h。照射组每孔加18F-FDG，使其活度浓度为实验设定浓度。空白孔加同体积培养基。加18F-FDG6、12、24h后每孔加20ul浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h后弃培养基,每孔加入DMSO150ul，震荡10min，在酶标仪上检测测各孔的OD值（波长570nm）。计算细胞增殖的抑制率。（5）细胞凋亡率的检测：以0.125％胰蛋白酶消化、培养液制成单细胞悬液，计数活细胞并调整细胞浓度5×105/ml。离心收集细胞，PBS洗涤，-20℃预冷的70％乙醇固定1h后，PBS洗涤，用5mg/mlRNA酶在37℃孵育30min，以10μg/ml碘化丙啶(Propidium iodide，PI)溶液染色，避光反应15min，流式细胞仪检测。（6）细胞内活性氧的测定：18F-FDG处理细胞6h后，PBS洗涤2次，分别加入150μl 20μmol/L DCFH-DA工作液，在CO2培养箱内37℃孵育30min，PBS洗涤3次后，以流式细胞仪在激发光波长485nm,发射光波长538nm处检测细胞荧光强度,每个样本计数10000个细胞，以WinMDI软件分析平均荧光强度(mean fluorescent intensity，MFI)。（7）RT-PCR检测P53基因,rad51基因表达：细胞加18F-FDG 24小时后，抽提总RNA：具体步骤见Trizol总RNA抽提试剂盒说明书。提取的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应。反应产物在凝胶中以100V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照,经Bandscan软件进行半定量分析,将测出各条带灰度值除以β-actin的灰度值,得到一相对强度(relative intensity ,RI),通过各浓度组的RI值比较可得出基因表达的变化规律。（8）统计学分析：所测数据用`x±s表示，采用SPSS(10.0)软件进行统计学处理，各组之间差异性比较采用两独立样本t检验，用直线回归分析数据变量间依存关系。
结果：（1）倒置显微镜观察到各实验组均出现典型的凋亡细胞，细胞体积变小、胞质浓缩、细胞核增大、甚至固缩、细胞破裂呈凋亡状态。随着18F-FDG增加，凋亡细胞密度明显增加。（2）加18F-FDG后6、12、24h，HepG2细胞的生长受到抑制，抑制率随着药物放射性浓度的增加及作用时间的延长显著的增加；（3）随着18F-FDG放射性浓度增加细胞凋亡率逐渐增加。 HepG2细胞凋亡率（％）分别为3.3±0.01，4.5±0.07，16.9±0.23（各组与对照组细胞凋亡率0.5±0.31比较，P<0.05）；（4）不同放射性浓度18F-FDG作用于HepG2细胞 6小时，受照细胞中活性氧含量均显著高于对照（p＜0.01），且随着18F-FDG放射性浓度增大，照射量增加，细胞中活性氧含量逐渐增加。（5）加不同放射性浓度18F-FDG24h后，P53基因，rad51基因，表达灰度值与内参β-actin灰度值之比RI随着18F-FDG浓度增加而增加。
结论：18F-FDG 能诱导HepG2细胞出现典型凋亡形态学变化，18F-FDG可通过发射的β+射线对HepG2细胞产生内照射，产生活性氧、造成Rad51基因过表达及促进P53基因表达，最终导致HepG2肝癌细胞凋亡。