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目的:
观察创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织TLR4、NF-κB p65的表达、早期炎细胞因子(TNF-α)、晚期炎症因子(HMGB1)的水平、iNOS的活性及NO的含量,并观察血必净对其影响。
方法:
1.清洁级SD大鼠110只,雌雄各半,根据随机数字表将大鼠分为正常组(n=10,A组),脓毒症模型组(n=50,B组),血必净干预组(n=50,C组),后两组大鼠左后肢皮下注射创伤弧菌悬液(浓度为6×108cfu/ml,剂量为0.1ml/100g)。C组大鼠于染菌后30min腹腔注射血必净注射液4ml/kg,每日2次。B组与C组分别在注射创伤弧菌后1h、6h、12h、24h、48h时活杀,各时相点动物数均为10只。无菌取部分肺组织于液氮中保存待用。
2.观察各组大鼠在染菌及药物干预后行为学改变、肺湿干比及肺组织病理,并随机取B组各个时间点大鼠1只全血做血培养。
3.采用RT-PCR法检测TLR4,NF-KB p65 mRNA的表达量,采用Western blot法测定HMGB1的蛋白表达量,采用ELISA法测定各组大鼠肺组织TNF-α的含量,采用试剂盒检测iNOS的活性和NO的含量。
4.实验资料采用均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS16.0进行处理组间比较采用方差分析,各组两两比较采用t检验。p<0.05为差异有显著性意义。
结果:
1.大鼠染菌3h后出现活动减少,进食饮水减少,6h后皮温升高,肢端及口唇发绀明显,精神萎靡,反应明显变慢,呼吸急促,竖毛现象,随着时间的推延,左后肢肿胀明显,远端暗紫色,不能承力,托着后肢行走,前述症状加重,12h与24h血培养均为阳性。经血必净干预后,大鼠出现类似脓毒症组的表现,但是时间延迟且症状有所减轻,正常大鼠无发热,活泼自如,呼吸平稳,进食正常,无下肢肿胀。
2.A组大鼠肺组织湿干比是(3.136±0.758)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染6 h(4.197±0.499)、12h(4.413±0.449)、24h(4.554±1.136)和48h(4.763±0.289)湿干比明显增大(P<0.05),呈逐渐递增趋势；与B组比较,C组24 h(3.882±0.657)、48h(3.765±0.699)肺组织湿干比明显减小(P<0.05),与A组比较,C组12h(3.847±0.596)、24 h(3.882±0.657)肺组织湿干比明显增大(P<0.05)。
3.A组大鼠肺组织TLR4 mRNA的表达是(0.569±0.141)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染后6 h(1.213±0.433)、12 h(1.029±0.401)、24 h(0.992±0.283)肺组织TLR4 mRNA表达量均明显增高(P<0.05)；与B组比较,C组6h肺组织TLR4mRNA表达量(0.737±0.224)明显减少(P<0.05),与A组比较C组12h(1.122±0.809)明显增高(P<0.05)。
4.A组大鼠肺组织NF-κB p65 mRNA的表达是(0.611±0.249)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染后6 h(1.406±0.687)与12 h(1.330±0.725)肺组织NF-κB p65 mRNA表达量均明显增高(P<0.05)；与B组相同时间点比较,血必净治疗干预后,C组6h肺组织NF-κB p65 mRNA表达量(0.810±0.362)明显减少(P<0.05),与A组比较,C组未明显增高(P>0.05)。
5.A组大鼠肺组织HMGB1的蛋白表达是(0.594±0.190)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染6 h(1.408±0.567)后肺组织HMGB1表达量明显增加(P<0.05),后逐渐增加,到24 h(2.415±1.064)肺组织HMGB1蛋白表达量达到峰值:与B组比较,血必净治疗干预后,C组24 h(1.440±0.451)肺组织HMGB1蛋白表达量明显减少(P<0.05)；与A组比较,其中12 h(1.421±0.477)、24 h(1.440±0.451)、48 h(1.519±0.648)肺组织HMGB1蛋白表达量仍明显增高(P<0.05)。
6.A组大鼠肺组织TNF-α的含量是(237.59±26.56)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染1 h(297.92±41.68)、6 h(303.22±25.83)、12 h(364.28±61.66)和24 h(306.88±55.62)TNF-α的含量明显增加(P<0.05),并于12 h达到峰值；与B组比较,C组12 h(294.68±41.31)肺组织TNF-α的含量明显减少(P<0.05),与A组比较,C组12h(294.68±41.31)、24 h(336.43±103.57)肺组织TNF-α的含量明显增加(P<0.05)。
7.A组大鼠肺组织iNOS的活性是(6.690±1.872)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染1 h(12.567±3.202)、6h(22.167±7.287)、12h(19.727±6.230)和24h(14.369±3.782)iNOS的活性明显增加(P<0.05),并于6h达到峰值；与B组相同时间点比较,C组6h(14.973±3.483)、12h(15.153±5.460)、24h(10.279±4.132)肺组织iNOS的活性明显降低(P<0.05)。
8.A组大鼠肺组织N0的含量是(4.94±1.480)；与A组比较,B组创伤弧菌菌感染1 h(14.534±3.817)、6h(31.515±7.014)、12h(41.320±7.281)、24h(32.818±5.417)及48h(24.815±6.004)N0的含量明显增加(P<0.05),并于12h达到峰值；与B组相同时间点比较,C组12h(30.932±5.190)、24 h(25.254±4.672)肺组织NO的含量明显降低(P<0.05)。
9.光镜下观察A组肺泡清晰,肺泡间隔较薄,未见充血及水肿,创伤弧菌感染48 h后,B组与A组比较肺内血管充血明显,局部有出血,肺间质水肿严重并伴有炎症浸润,肺泡间隔分界不清,肺泡腔塌陷明显,C组间质水肿明显,但明显较B组轻,肺泡腔仍存在。
结论:
1.TLR4-NF-κB炎症信号通路可能参与大鼠创伤弧菌脓毒症肺脏的损伤过程。
2.血必净可能通过抑制TLR4-NF-KB炎症信号通路及HMGB1的表达,减轻创伤弧菌脓毒症大鼠肺脏损伤。