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目的脑血管病是危害人类生命健康的常见病、多发病,脑血管病的防治一直是我国卫生工作和医学研究的一项重要课题。黄角颗粒是武汉市第一医院神经内科在多年临床经验总结的基础上研制的治疗脑卒中的有效院内制剂。本课题拟针对脑缺血后的病理生理机制,在中医基础理论指导下,以神经细胞凋亡为切入点,通过在体和体外细胞培养实验,观察黄角颗粒对caspase依赖的线粒体内源性凋亡途径以及非caspases介导的AIF凋亡途径的作用来深入探讨其脑保护机制,旨在深层次探索中药复方的药效及其作用机理。方法1.在体实验:取清洁级Wistar大鼠若干只,参照文献采用longa改进线栓法制作大脑中动脉栓塞动物模型。按体重随机分为六组:假手术对照组(简称假手术组)、模型对照组(简称模型组)、尼莫地平组(简称西药组)、黄角颗粒10g/kg、5g/kg、2.5g/kg组(简称大、中、小剂量组)。第一部分观察黄角颗粒对实验性局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及脑组织形态变化的影响,测定脑梗死大鼠脑组织含水量及脑组织梗死体积。第二部分采用原位细胞凋亡检测及免疫组化方法检测脑组织神经细胞bcl-2,bax,Caspase-3阳性细胞的表达等,观察黄角颗粒对实验性局灶性脑梗死大鼠caspase依赖的线粒体内源性凋亡途径的影响。2.体外细胞培养实验:即第三部分,采用“血清药理学”方法,利用黄角颗粒含药血清分别对神经研究中的常用的工具细胞PC-12细胞分化的类神经元缺氧缺血离体模型进行干预,再进行观察凋亡通路中AIF的变化,并与西药丁咯地尔盐酸盐进行比较,探讨黄角颗粒对细胞缺氧缺血保护作用实为拮抗凋亡通路的分子机制。结果1.实验性局灶性脑梗死大鼠模型组一般状态差,进食量锐减,逐渐消瘦,毛色灰暗无光泽,无脱毛,偏瘫症状明显,表现为左侧肢体废用或力弱,以前肢为重,行走呈逆钟向追尾状。黄角颗粒各剂量组及尼莫地平组动物一般状态较模型组好,治疗3天后治疗组和模型组症状均有不同程度恢复,治疗组症状改善明显,尤以大剂量治疗组为佳。2.实验性局灶性脑梗死大鼠脑组织含水量及梗死体积的变化:假手术组脑组织含水量无显著变化,未见梗死灶;模型组脑组织含水量显著增加,均出现梗死灶;而尼莫地平组和黄角颗粒不同剂量治疗组的脑组织含水量均显著降低,且梗死体积均明显低于模型组,与模型组比较有显著差异(P＜0.01)。光镜下可见,假手术组皮层神经元形态结构正常;模型组大鼠缺血侧大脑皮层神经元呈缺血性改变,大量神经元变性坏死、出现空泡,表现为胞体缩小呈三角形,胞浆为伊红性,核固缩深染,核仁消失等;海马CA1区神经元排列稀疏紊乱,有不同程度神经元脱失现象。黄角颗粒组、尼莫地平组缺血侧皮层神经细胞亦呈缺血改变,但只有部分细胞固缩,且深染程度较轻,细胞无缩小,细胞周围间隙改变不明显。3.实验性局灶性脑梗死大鼠脑神经细胞bcl-2,bax阳性细胞的比较:模型组大鼠脑神经细胞凋亡阳性细胞数及bax阳性细胞数显著高于正常组,bcl-2阳性细胞数显著低于正常组(P＜0.05,P＜0.01);中药大、中、小剂量组及西药组大鼠脑神经细胞凋亡阳性细胞数及bax阳性细胞数显著低于模型组,bcl-2阳性细胞数显著高于模型组(P＜0.05,P＜0.01);中药大剂量组大鼠脑神经细胞凋亡阳性细胞数及bax、bcl-2阳性细胞数与西药组间无显著性差异(P＞0.05)。4.实验性局灶性脑梗死大鼠脑神经细胞Caspase-3阳性细胞的比较:模型组与假手术组比较,Caspase-3蛋白阳性细胞数目明显增多(P＜0.01),黄角颗粒大、中剂量组与西药组均可减少脑缺血诱导Caspase-3蛋白阳性细胞数目,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01),尤以大剂量组为显著。5.利用黄角颗粒含药血清对PC-12细胞分化的类神经元缺氧缺血离体模型进行干预,经过24小时的缺氧缺血复氧复血清1小时后,对照组仍可观察到明显的AIF核移位,而黄角颗粒组和盐酸丁咯地尔组则未观察到AIF的核移位;缺血缺氧复氧复血清1小时与复氧复血清3小时相比,盐酸丁咯地尔和黄角颗粒含药血清均可同样阻止AIF的激活释放。结论急性期的有效治疗是影响预后的关键环节,针对急性期标实为主的临床证候特点,醒神定惊,祛除痰浊瘀血,通导腑实不失为适宜有效的治疗措施。由水牛角和生大黄两味药组方的黄角颗粒能够改善实验性脑梗死大鼠的梗死体积,减轻脑水肿,改善神经功能缺损程度。在caspase依赖的线粒体内源性凋亡途径中,黄角颗粒通过上调脑缺血诱导的Bcl-2蛋白表达,同时下调Bax蛋白表达,使Bcl-21Bax比值升高,促使Bax-Bcl-2异源二聚体形成;有效抑制Caspase-3的激活,从而直接抑制缺血神经元的凋亡,减轻脑缺血所致的脑损伤,发挥脑保护作用。同时,在AIF介导的caspase非依赖信号通路的研究中发现,黄角颗粒可有效防止AIF的激活释放,使细胞无法进入非Caspases介导的AIF凋亡途径。以上结果为黄角颗粒治疗脑梗死提供了实验依据,这可能是其治疗缺血性卒中的分子机制之一。