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目的第一部分:TBK1是干扰素β产生以及抗病毒天然免疫反应的关键蛋白。TBK1的修饰会影响抗病毒天然免疫反应。明确WAZX2泛素连接酶对于TBK1的泛素化修饰作用,并且探究WAZX2在抗病毒天然免疫反应中的调控作用。第二部分:塞泽里综合征是一种具有抗凋亡能力的皮肤T细胞淋巴瘤。最近研究发现转录因子SATB1在塞泽里综合征中对抗凋亡的重要性。课题组前期研究发现在某些条件下SNF5是SATB1的上游调节蛋白,并且二者在塞泽里综合征细胞中都低表达。明确SNF5和SATB1在塞泽里综合征中对其抗凋亡能力产生的影响。因此,设计SWI/SNF复合物为靶点的药物可能会成为治疗塞泽里综合征的一个新思路。方法第一部分:1.通过带有GFP荧光的VSV-Δ51病毒对HEK293T细胞进行感染,倒置显微镜观察以及流式细胞术检测被感染HEK293T细胞GFP发光情况。2.通过仙台病毒SeV感染HEK293T细胞,提取细胞的RNA,反转录为cDNA后,Real-time PCR检测IFN-βmRNA水平情况。同时荧光素酶报告基因实验检测IFN-β启动子活性。3.用LPS刺激或VSV病毒感染iBMDM细胞,分别在4h、8h和12h收取细胞并提取RNA,检测WAZX2 mRNA水平情况。4.通过荧光报告基因实验检测RIG-I N、MAVS、TBK1、IKKi、IRF3 5D等接头蛋白激活的信号后,WAZX2对IFN-β启动子活性的影响。同时,通过免疫共沉淀技术检测WAZX2和接头蛋白的相互作用。5.采用免疫共沉淀方法检测WAZX2对TBK1泛素化水平修饰的改变以及泛素化修饰的类型。第二部分:1.通过基因芯片分析,研究SNF5表达缺失,对SATB1表达的影响。2.利用qRT-PCR和Western Blot的方法验证SNF5缺失表达的小鼠胚胎成纤维细胞、胸腺细胞、T细胞以及淋巴瘤细胞中SATB1的表达情况。3.将SNF5过表达载体转染于293T细胞中,或者在T细胞淋巴瘤细胞系中通过免疫共沉淀技术检测相互作用。4.采用qRT-PCR技术检测SATB1在SNF5低表达的塞泽里综合征细胞中的表达情况;同时,在塞泽里综合征细胞中恢复SATB1、SNF5的表达,或者恢复SNF5表达的同时抑制SATB1的表达,利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western Blot的方法观察Caspase信号通路中相关蛋白的表达水平。结果第一部分:1.荧光显微镜下发现带有GFP荧光的293T细胞,在过表达WAZX2的情况下比对照组减少;并且流式细胞术检测带有GFP荧光的HEK293T细胞也减少。利用siRNA抑制HEK293T细胞中WAZX2的表达,则结果相反。2.SeV感染WAZX2过表达的HEK293T细胞后,IFN-βmRNA表达水平升高,并且荧光素酶报告基因实验发现IFN-β的启动子活性增强;siRNA抑制293T细胞中WAZX2表达后,结果相反。3.LPS刺激或VSV病毒感染iBMDM细胞后,wazx2 mRNA表达水平上升高。4.在RIG-I N、MDA5、MAVS、TBK1所激活的信号通路中,WAZX2对IFN-β的启动子活性都具有上调作用,但是对IKKi和IRF3 5D所引起的IFN-β的启动子活性无明显改变;WAZX2缺失表达后结果相反。免疫共沉淀技术发现外源的TBK1与外源的WAZX2存在相互作用。5.WAZX2使TBK1泛素化水平增加;WAZX2表达缺失后,结果相反。WAZX2增加了TBK1 K63位形式的泛素化。第二部分:1.基因芯片分析发现,在SNF5表达缺失情况下,SATB1表达会下降。2.qRT-PCR和Western Blot的方法验证发现SNF5缺失表达的小鼠胚胎成纤维细胞、胸腺细胞、T细胞以及淋巴瘤细胞中SATB1的表达会随之下调。3.通过比对人和酵母中SNF5和SATB1氨基酸序列,发现人的SNF5与酵母中的序列相似度达到36%,而人的SATB1与酵母中的序列相似度达到26%;进一步通过免疫共沉淀技术发现在Hut78和HEK293T细胞系中SATB1与SNF5存在相互作用。4.在SNF5缺失的小鼠CD8~+T细胞淋巴瘤细胞以及Hut78细胞中,SATB1在RNA水平呈现低表达;在Hut78细胞中恢复SATB1、SNF5的表达,发现细胞抗凋亡能力减弱,被切割的Caspase8和Caspase3蛋白水平升高;当恢复SNF5表达的同时抑制SATB1的表达,发现细胞的抗凋亡能力无明显变化,被切割的Caspase8和Caspase3蛋白水平有所减少。结论第一部分:1.WAZX2对于HEK293T细胞的抗病毒能力起到了正向调控作用。2.WAZX2正向调控IFN-βmRNA水平表达,并且正向调控IFN-β信号通路。3.巨噬细胞系中,在LPS的刺激下或者是VSV病毒的感染下会影响正向调节wazx2 mRNA水平的表达。4.在RIG-I N、MAVS、TBK1、IRF3 5D所激活的信号通路中,WAZX2对IFN-β启动子活性都具有正向调控的作用;并且发现细胞中外源的WAZX2与TBK1存在相互作用。可见,TBK1很可能是WAZX2的靶分子。5.外源WAZX2使外源TBK1的泛素化增加,并且增加的是K63位形式的泛素化修饰。WAZX2可能是通过对TBK1增加K63位形式的泛素化,增强了TBK1的功能,最终正向调控了抗病毒天然免疫反应。第二部分:1.在一些类型的细胞中,SWI/SNF复合物直接调节了SATB1的表达。2.在一些类型的细胞中,SNF5表达缺失导致SATB1的低表达。3.SATB1特异地与SNF5(或SWI/SNF复合物)相互作用。4.在塞泽里综合征中,SNF5低表达可引起SATB1表达下调,最终导致该疾病具有抗凋亡的能力。