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背景:可卡因是仅次于大麻的第二大神经兴奋剂,药物成瘾性很强。成瘾患者表现为低意识的自控力,强迫觅药和滥用,严重影响个人身体健康,易引发社会问题。开发有效治疗可卡因成瘾新药一直是热点。现有研究中,可卡因通过直接或间接的作用方式,改变与奖赏相关的伏隔核(NAc)和前额叶皮质(PFC)等脑区的多巴胺(Dopamine,DA)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)等神经递质释放。长期用药损害神经元,破坏自然奖赏机制,引起的适应性变化,产生耐受,降低自然奖赏刺激反应,进而增加药物摄取量。在分子水平上,药物刺激可引起DNA甲基化、组蛋白修饰、MicroRNAs等表观遗传学的变化,进而调控特定基因表达变化,改变离子通道、受体、细胞信使和细胞骨架等蛋白的表达。其中,简化DNA甲基化测序(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)作为单精度DNA甲基化检测技术,已用于发育生物学进程、癌症的DNA甲基化研究。RNA-Seq已经发展为研究表达谱的成熟技术。充分利用下一代测序技术可加速可卡因成瘾机制的研究。
目的:
1.获得可卡因成瘾中的DNA甲基化图谱和基因表达谱。
2.鉴定出可卡因模型中由DNA甲基化水平改变而引起的表达变化的基因。
3.探索DNA甲基化在可卡因成瘾的作用。
方法:
1.选取经可卡因训练的条件位置偏好(CPP)的小鼠,取可卡因处理组和盐水处理的对照组NAc和PFC的组织作为实验材料;
2.对所取的实验材料进行DNA甲基化的RRBS(40~380bp)测序和基因表达谱的RNA-Seq测序;
3.使用自主开发的DNA甲基化分析流程,得到差异甲基化区域(Differentialmethylated region,DMRs),通过Cytoscape的ClueGO对DMRs相关基因进行通路富集;
4.使用tophat和cuffdiff软件对RNA-Seq数据进行差异表达基因分析,获得差异表达基因,再通过Cytoscape软件的ClueGO进行差异基因的通路富集;
5.联合分析DNA甲基化数据和RNA-Seq表达谱数据,找出潜在的与可卡因成瘾相关的基因及通路。
结果:
1.整体水平上,RRBS的富集区域DNA甲基化水平变化不大。
2.在NAc中,有2,243个DMRs甲基化水平下降,有622个基因的启动子与甲基化水平下降的DMRs相关;1,068个DMRs甲基化水平上升,391基因启动子与甲基化水平上升的DMRs相关;差异表达基因中,646个基因表达下降,776个基因表达上升。在PFC中,有1,276个DMRs甲基化水平下降,有326个基因的启动子与甲基化水平下降的DMRs相关;1,800个DMRs甲基化水平上升,417基因启动子与甲基化水平上升的DMRs相关;差异表达基因中,804个基因表达下降,783个基因表达上升。
3.对DMRs相关的基因和差异表达基因分别进行Cytoscape的ClueGO的通路富集分析。DMRs相关的基因的ClueGO通路富集中:NAc中有刺激神经组织的配体受体相互作用、钙信号通路、唾液分泌等相关通路;PFC中有可卡因成瘾、谷氨酸突触和赖氨酸降解等相关通路。表达差异相关基因的ClueGO通路富集中:NAc中有可卡因成瘾、尼古丁成瘾、安非他命成瘾、突触囊泡循环、GABA能的突触、氧化磷酸化、长程增强效应等相关通路;PFC中有尼古丁成瘾、吗啡成瘾、突触囊泡循环、GABA能的突触、氧化磷酸化、刺激神经组织的配体受体相互作用、长时程抑制、赖氨酸降解、精氨酸代谢等通路。
4.DMR与差异基因联合分析中,在NAc中得到9个基因相关的DMR甲基化趋势和基因表达趋势相反,在PFC中有2个。
结论:
1.整体上,DNA甲基化水平在酶切区域变化不大,但仍有部分基因发生DNA甲基化变化,进而可能调控基因表达改变。
2.表达谱中,NAc和PFC的GABA的合成和释放都受到抑制,表明抑制GABA的释放是可卡因成瘾的重要过程。
3.另外在NAc和PFC的差异表达通路中都有赖氨酸的代谢,暗示可卡因成瘾可能调控基因表达的组蛋白的甲基化修饰有关。