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蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)是从软蜱唾液内分离鉴定出的抗凝分子,为60个氨基酸组成的单链酸性多肽,是一种慢速而结合紧密的具有高度选择性的Ⅹa因子(FⅩa )抑制剂,与Kunitz型抑制剂有同源性。在进行提高TAP对FⅩa抑制活性方面的研究时发现,将TAP的第一位酪氨酸残基替换为色氨酸,把第十位天冬氨酸替换为精氨酸,产生的TAP双重突变体,可使其抗Ⅹa的活性增加37倍。血小板黏附和聚集的一个重要成分是其表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GpIIb/IIIa)受体。研究发现GpⅡb/Ⅲa与其配体的结合主要是通过构象改变而识别其配体中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列来完成的,通过基因工程或人工合成含有以上序列的多肽能抑制纤维蛋白原等配体与GpⅡb/Ⅲa受体的结合,从而具有抗凝作用。目前含RGD序列的多肽是临床研究的热点。本研究采用环嫁接的方法,将RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)序列在一定的构象限制下导入TAP活性位点以外具有稳定的β折叠指状结构的顶端。将此构建的嵌合体基因在酵母表达系统中进行表达,以期获得一种既有抗Ⅹa的作用又有抑制血小板聚集功能(兼具纤溶酶激活功能)的双功能、高效抗栓物质。首先参照天然TAP的氨基酸顺序,设计将TAP的Y1的酪氨酸基因替换为色氨酸基因以及D10的天冬氨酸基因替换为精氨酸基因,产生双重突变体TAP的基因序列。在编码TAP指状结构的K30的赖氨酸和G31的甘氨酸之间插入编码RGDS氨基酸的基因序列。在5’及3’端分别加入EcoRI、NotI限制性酶切位点,全长共64个氨基酸残基编码序列共216个碱基。全基因分4个片段人工合成,并设计三个相应接头。磷酸化后用T4-DNA连接酶16℃连接过夜。PCR扩增、胶回收后与PMD18-T质粒连接,再转入大肠杆菌DH5a。质粒抽提后用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术特异性扩增TAP基因片段,胶回收、纯化PCR反应产物后用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切并与同样经EcoRI和NotI双酶切的pPIC9K真核表达载体连接,将连接产物再次转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆质粒,经双酶切,电泳及DNA测序鉴定,证实插入序列为目的基因序列。将筛选后的表达载体质粒pPIC9K-TAP经限制性内切酶SalⅠ酶切线性化后用电转化的方法转入感受态GS115酵母菌,得到的转化子经MD平板与MM平板、G418抗性筛选,PCR鉴定后,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-TAP,用甲醇诱导分泌表达目标蛋白。经SDS-PAGE分析后,将表达产物进行初步的分离纯化后用正常人的血浆进行白陶土部分凝血酶原时间测定(APTT)和血浆凝血酶原时测定间(PT)试验检测产物抑制凝血酶活化的作用,采用血小板聚集试验(platelet aggregation test, PAgT)检测表达产物是否有结合血小板的活性。研究结果:经过酶切,PCR,序列分析证实成功构建了含TAP-RGDS基因的重组分泌型表达质粒pPIC9K/TAP,重组质粒电转化GS115酵母菌,并经MD平板与MM平板、G418抗性筛选,及PCR鉴定后,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-TAP,用甲醇诱导分泌表达目标蛋白。经SDS-PAGE分析,在标准分子量8kD左右有一条特异蛋白带,说明培养上清中确有外源蛋白表达。表达产物进行抗凝血初步试验,证明表达产物有抗凝血因子活性和抗血小板的作用。研究结论:①采用基因合成的方式成功构建rTAP-RGDS的真核表达载体。②通过诱导该载体表达了重组基因产物。③经研究表明该表达产物的粗提物具有抗抗凝血因子活性和抗血小板的作用。