背景：染色体3p21.3区域的异常,与肺,肾,头颈部,胸部,子宫颈癌,胃肠道等肿瘤的形成密切相关。这些异常包括纯合性缺失和杂合性丢失及蛋白表达的异常,提示该区域肿瘤抑制基因的存在。肿瘤抑制基因的存在为肿瘤的分子治疗提供了机会,在过去几十年,人们投入了大量的精力,以明确3p21.3区候选的肿瘤抑制基因并对其生物学功能进行研究。3p21.3着丝粒的关重要区域边界(也叫LUCA)大约120kb处现已发现9个肿瘤抑制基因：HYAL2, Hyall, FUS1, RASSF1, BLU, NPRL1,101F6, p16和CACNA2DA基因。这些基因的产物广泛参与生物学过程,包括细胞的增殖、细胞周期动力学、信号转导、离子交换和转运、细胞凋亡,其功能已得到很好的阐明。3p21.3还包含卢卡区以外的其他候选肿瘤抑制基因,目前还没有得到很好的研究。为了探索潜在的3p21.3区域的肿瘤抑制基因,Kiss etal.通过基因组测序发现并克隆了Leucine Zipper Transcription Factor Like 1 (LZTFL1).LZTFL1距3p21.3末端卢卡区约5 Mb处。Northern blot分析表明LZTFL1 mRNA广泛表达于人和老鼠各类组织。序列分析表明人类和小鼠LZTFL1具有90.6%的同源性。LZTFL1包含299氨基酸残基,分子量大小约为34.6KD,并含有一个基本结构域,一个螺旋-螺旋结构域,一个亮氨酸拉链结构域,提示LZTFL1在功能上可能是一个肿瘤抑制基因。然而,目前关于LZTFL1是肿瘤抑制基因缺乏生物学和遗传学上的证据。肿瘤的发展往往与肿瘤细胞分化的缺失相关,但根本原因和机制仍知之甚少。人类实体肿瘤的绝大部分都是属于不同类型的起源上皮细胞癌。E-cadherin是维持正常上皮完整性和极性的跨膜糖蛋白,是以嗜同性方式(同种分子间拉链式结合)介导同型细胞-细胞间黏附的细胞黏附分子,其细胞浆尾段通过catenin包括α-catenin和β-catenin及其他相关蛋白结合间接与细胞骨架肌动蛋白互相作用,因此,粘合连接相关的蛋白质,对维持上皮细胞分化的状态和极性至关重要。黏附连接破坏可以通过上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的过程产生侵袭性的间质细胞,此过程可以使极性上皮细胞转化为失去极化具有侵袭性间质细胞。EMT被认为是潜在的肿瘤形成的机制之一。质膜E-cadherin的丢失可以使细胞胞浆池β-catenin的水平上升,接着β-catenin可以易位到细胞核,激活基因,促进细胞增殖和EMT。本研究为了证实LZTFL1是否具有肿瘤抑制基因的功能,我们提出3个问题：首先,在肿瘤组织中,LZTFL1的表达是否下调,LZTFL1表达的下调是否具有任何临床意义?第二,肿瘤细胞重新获得LZTFL1的功能是否能够抑制肿瘤细胞的生长?最后,LZTFL1抑制肿瘤生长的潜在机制是什么?方法和结果：1. LZTFL1在人肿瘤组织中的表达及临床意义为了研究LZTFL1的功能,首先我们制备并纯化了LZTFL1兔多克隆抗体,我们利用此抗体,用免疫组化方法,检测了组织芯片中正常组织及相应匹配的肿瘤组织LZTFLl的表达水平。在正常的乳腺,食道,胰腺,胃,卵巢,前列腺,肺,结肠,甲状腺,肾脏,膀胱,肝脏的正常组织上皮细胞,可见较高水平的LZTFL1表达,而在几乎所有相应的浸润性癌组织样本中,只有弥散的、低水平LZTFL1的表达。对组织芯片每一类正常的和相应癌组织样本多个病例的分析表明,LZTFL1的表达在上述人肿瘤组织明显下调。为了进一步阐明在癌症患者中LZTFL1下调的临床意义,我们用免疫组化的方法检测了84名胃癌患者肿瘤组织中的LZTFL1的表达水平。肿瘤组织样本LZTFL1表达下降程度与TNM分期呈显著负相关,并与淋巴结转移个数呈显著负相关,LZTFL1表达水平与病人的生存时间显著相关,中等或较强表达LZTFL1肿瘤病人总的生存期明显好于那些无或弱表达LZTFL1肿瘤病人2.体内外实验对LZTFL1生物学功能的研究为了明确LZTFL1在肿瘤发生中起的作用,我们进行了获得性功能的研究,是否在肿瘤细胞中过表达LZTFL1可以抑制肿瘤细胞生长。我们使用了诱导表达系统Hela-Tet-on,加入强力霉素后,诱导培养的Hela-Tet-on细胞能持续表达LZTFL1.我们发现在锚定非依赖性的情况下(软琼脂集落形成实验),LZTFL1对肿瘤细胞的生长有抑制作用。实验结果显示,Hela-Tet-on细胞4周后形成大量的克隆,在Dox诱导后,LZTFL1表达的细胞株克隆形成数目显著减少。作为对照的Hela-Tet-on细胞加或不加强力霉素,Hela-Tet-on-EGFP细胞加或不加强力霉素和Hela-Tet-on-LZTFL1-EGFP细胞不加强力霉素克隆形成数目差异不大,提示LZTFL1确实能够特异性的抑制锚定非依赖性的肿瘤细胞的生长。我们还在HT-29细胞中测试了是否过表达LZTFL1能抑制肿瘤细胞的克隆形成,实验结果证实在这此细胞中LZTFL1有类似的抑制作用。由于在胃癌病人组织LZTFL1的表达下调与肿瘤的转移有显著相关性,我们进一步检测了LZTFL1在细胞迁移上的作用。Hela-Tet-on-LZTFL1-EGFP在强力霉素诱导下上调表达LZTFL1后,穿过Transwell小室的细胞数目显著降低。在阴性对照,强力霉素诱导后并未对Hela-Tet-on细胞或是Hela-Tet-on-EGFP细胞的迁移产生影响,通过Transwells小室的迁移细胞数在Hela-Tet-on细胞或Hela-Tet-on-EGFP细胞有或无强力霉素诱导,及Hela-Tet-on-LZTFL 1-EGFP细胞无强力霉素诱导,穿过Transwell小室的细胞数目无明显区别。为了进一步证实是否在体内过表达LZTFL1也能抑制肿瘤细胞的生长,克隆Hela-Tet-on-LZTFL 1-EGFP细胞及Hela-Tet-on细胞皮下注射到裸鼠左后肢。5周后,注射Hela-Tet-on细胞的裸鼠形成很大的肿瘤,而在含强力霉素水喂养的诱导表达LZTFL1的注射Hela-Tet-on-LZTFL 1-EGFP细胞的裸鼠,相比较未予强力霉素水喂养裸鼠,肿瘤的大小显著缩小。我们的结果表明,LZTFL1在体内明显抑制肿瘤生长。3. LZTFL1抑制肿瘤细胞生长的分子机制的研究大量研究表明,在肿瘤中,许多抑癌基因的失活是由于抑癌基因启动子区CpG岛异常甲基化引起的表观基因的沉默,或是由于组蛋白去乙酰化酶过表达引起的,所以为了初步研究LZTFL1在肿瘤细胞中失活的机制,我们分别用DNA甲基化酶抑制剂5’-氮杂2’-脱氧胞苷和丁酸钠(组蛋白去乙酰化酶抑制剂,HDAC抑制剂)处理人肠癌细胞HT-29。在5’-氮杂2’-脱氧胞苷处理和未处理的细胞之间,LZTFL1的表达水平没有变化,而丁酸钠处理后LZTFL1表达显著增高。其他的HDAC抑制剂具有相似上调HT-29的LZTFL1表达的效果。这些结果提示LZTFL1在HT-29细胞中失活是由于染色体结构的改变所引起的。丁酸钠是肠道内自然产生的复合物,它能诱导肠上皮细胞的分化。丁酸钠处理后,HT-29细胞LZTFL1表达上调提示LZTFL1的表达水平与细胞的分化状态相关。为了在体内验证这个假设,我们用免疫组化染色的方法用LZTFL1抗体研究了小鼠小肠隐窝-绒毛轴LZTFL1的表达情况。小肠上皮处于持续自我更新的过程,在隐窝处的干细胞处于快速增殖和分化的状态,并不断向肠绒毛的顶端的迁徙。实验结果表明,沿着隐窝-绒毛轴,LZTFL1的表达水平逐渐递升,在隐窝处,LZTFL1表达水平最低,在绒毛的顶端,LZTFL1的表达最强,进一步,我们用共聚焦荧光显微镜进行了LZTFL1和E-cadherin/β-catenin共定位研究。在正常分化的肠上皮细胞中,LZTFL1的表达与E-cadherin在质膜上重叠,而在结肠肿瘤中,由于LZTFL1的表达缺失,不具有共定位的特征。LZTFL1和E-cadherin的共定位提示LZTFL1可能可以稳定E-cadherin介导的黏附连接。的确我们的实验结果表明,用phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)处理细胞(PMA是一种已知的能够破坏上皮细胞紧密连接的分散因子),相比较EGFP-HT-29或是HT-29细胞,表达LZTFL1的HT-29细胞能更耐受PMA诱导的细胞分散。结论：我们的研究结果表明,LZTFL1是一个肿瘤抑制因子,LZTFL1表达缺失有显著的临床意义。胃癌患者中,LZTFL1表达水平可作为一个独立的判断预后的指标。我们推测,LZTFL1通过促进肿瘤细胞的分化,从而抑制肿瘤的生长,通过抑制上皮-间质转化从而抑制肿瘤细胞转移。在肿瘤细胞中上调表达LZTFLl可能对癌症分化治疗具有临床价值。