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研究目的胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度极高的肿瘤,由于其组织具有高度纤维化及缺乏血管的特征,以及癌细胞内发生的一系列代谢重编程改变,使得胰腺癌至今几乎尚无有效的治疗方法。我们在研究过程中发现谷氨酰胺酶(GLS)的反义长链非编码RNA(lncRNA GLS-AS)在胰腺癌中发挥着调控肿瘤发生发展的作用。同时,我们发现lncRNA GLS-AS在胰腺癌中的表达与肿瘤营养应激微环境相关。因此,本研究旨在将胰腺癌营养应激微环境与lncRNA GLS-AS联系起来,逐步揭示lncRNA GLS-AS调控GLS表达的机制,及其如何通过c-Myc/GLS通路在营养应激微环境中介导胰腺癌细胞代谢重编程,以此为胰腺癌的治疗提供新的思路以及理论基础。研究方法通过高通量测序分析筛选出胰腺癌组织(PC)与癌旁正常组织(NP)差异表达的lncRNA GLS-AS(AK123493.1)作为研究对象。Northern Blot实验检测lncRNA GLS-AS在胰腺癌组织、细胞中的表达;通过RNA荧光原位杂交技术(RNA-FISH)明确lncRNA GLS-AS在胰腺癌细胞系BxPC-3、PANC-1中的亚细胞定位。收集武汉协和医院胰腺癌患者手术标本,包括PC和与之对应的NP组织30对;使用荧光定量PCR技术检测lncRNA GLS-AS和GLS mRNA的表达。在胰腺癌细胞系BxPC-3和PANC-1细胞中转染lncRNA GLS-AS的小干扰RNA或过表达质粒。通过MTT实验、平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖活性;划痕实验、Transwell实验分别检测细胞的迁移,侵袭能力。再使用慢病毒包被lncRNA GLS-AS的小干扰RNA,包被的慢病毒在转染PANC-1细胞后用于构建裸鼠异种移植瘤模型,以观察转染后细胞在体内生长、转移能力的改变。用荧光定量PCR技术检测胰腺癌细胞系在转染lncRNA GLS-AS的小干扰RNA或者过表达质粒后,以及30对胰腺癌组织中lncRNA GLS-AS、GLS mRNA表达;同时用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测GLS蛋白水平。使用RNA原位杂交(RNA-FISH)与GLS蛋白免疫荧光共染,观察lncRNA GLS-AS与GLS蛋白在胰腺癌组织与胰腺癌细胞系中共定位的情况。针对lncRNA GLS-AS与GLS前体RNA(GLS pre-mRNA)分别设计RNA探针,使用RNA荧光原位杂交技术对lncRNA GLS-AS与GLS mRNA在胰腺癌细胞中的共定位进行检测。通过体外转录技术人工合成lncRNA GLS-AS的不同部位片段,并用生物素标记,进一步用RNA pulldown技术探究lncRNA GLS-AS与GLS前体RNA(GLS pre-mRNA)的结合位置。α-鹅膏蕈碱阻断胰腺癌细胞系RNA合成后,观察转染lncRNA GLS-AS小干扰RNA或者过表达质粒对GLS pre-mRNA稳定性的影响。利用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)证明ADAR1与Dicer在胰腺癌细胞中结合。RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)证明ADAR1/Dicer蛋白复合体与GLS-AS/GLS pre-mRNA双链RNA(dsRNA)复合体结合。在胰腺癌细胞系中分别使用小干扰RNA敲低ADAR1与Dicer表达后,荧光定量PCR检测lncRNA GLS-AS,GLS pre-mRNA表达水平,以及α-鹅膏蕈碱处理上述转染细胞后GLS pre-mRNA的稳定性;Western Blot检测转染细胞中ADAR1、Dicer、GLS蛋白水平。体外模拟胰腺癌组织微环境,包括低氧、酸性、低糖以及低谷氨酰胺,荧光定量PCR检测lncRNA GLS-AS的表达,探究lncRNA GLS-AS在胰腺癌中低表达的驱动因素。RNA荧光原位杂交检测低糖、低谷氨酰胺环境下lncRNA GLS-AS的表达水平。荧光定量PCR、Western Blot检测低糖、低谷氨酰胺环境中GLS mRNA及蛋白的表达。Western Blot检测低糖、低谷氨酰胺环境中c-Myc蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀(ChIP)验证c-Myc蛋白与lncRNA GLS-AS上游启动子结合序列。双荧光素酶报告基因检测c-Myc蛋白对lncRNA GLS-AS启动子转录活性的影响。LncRNA GLS-AS的慢病毒载体转染BxPC-3细胞系,以慢病毒空载体作为阴性对照(LV-Vector),构建裸鼠异种移植瘤模型,观察lncRNA GLS-AS过表达在体内对肿瘤生长、转移的影响。研究结果长链非编码RNA GLS-AS(AK123493.1)在胰腺癌组织以及胰腺癌细胞系中低表达,且在细胞核内富集。体外细胞实验以及裸鼠异种移植瘤模型表明lncRNA GLS-AS低表达可以促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭。胰腺癌组织中LncRNA GLS-AS与GLS表达水平呈明显负相关,在胰腺癌细胞中证实lncRNA GLS-AS低表达主要通过升高GLS蛋白水平来增强肿瘤细胞的生长、侵袭能力。LncRNA GLS-AS在胰腺癌细胞系中通过ADAR1/Dicer诱导的RNA沉默机制抑制GLS表达。营养应激导致胰腺癌细胞中c-Myc蛋白表达升高,后者可与lncRNA GLS-AS基因的启动子序列相结合,抑制其转录活性,从而引起细胞中lncRNA GLS-AS的表达下调。最后,在lncRNA GLS-AS过表达的裸鼠异种移植瘤模型中验证了其在体内对肿瘤生长和转移存在抑制作用。结论通常情况下,胰腺肿瘤细胞中谷氨酰胺酶(GLS)的反义长链非编码RNA GLS-AS(lncRNA GLS-AS)可与GLS基因的前体RNA(GLS pre-mRNA)相结合,在细胞核内形成双链RNA(dsRNA),通过ADAR1/Dicer依赖的RNA沉默机制抑制GLS的表达。在营养应激环境中,c-Myc蛋白的升高通过抑制lncRNA GLS-AS启动子转录活性,导致lncRNA GLS-AS在胰腺癌中低表达,由此削弱了lncRNA GLS-AS对GLS表达的抑制效应,促使GLS表达升高。综上,我们的研究揭示了一种新的lncRNA介导的c-Myc/GLS途径,在胰腺癌应对营养应激微环境而进行的代谢重编程中发挥重要作用。这不仅有助于我们理解肿瘤营养应激与lncRNAs表达调控之间的相互作用关系,而且为lncRNA GLS-AS作为胰腺癌潜在的治疗靶点提供有限但可靠的理论依据。