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目的:心血管疾病引起的死亡人数占全球人口死亡总数的三分之一,而罹患缺血性心脏病的死亡人数居心血管疾病死亡人数之首。冠状动脉梗阻是造成心肌缺血的主要原因,尽管心肌缺血后在最短的时间内恢复缺血心肌供血是目前临床首选的治疗方式,但是缺血心肌恢复血液灌注后,供血和供氧的恢复可能是促进心肌细胞炎症和凋亡反应增高的直接原因,造成再灌注后的心肌细胞损伤进一步加重;因此,寻找有效方式降低心肌缺血/再灌注后的心肌细胞损伤,改善心功能各项指标,将为临床提高冠状动脉介入手术的效果提供新的治疗策略。醉茄素A是从醉茄提取的主要生物活性成分,近年来研究发现醉茄素A具有抗炎、抗氧化作用,然而醉茄素A与缺血性心脏病的关系尚不明确。本文拟探讨醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用,结合在体动物模型、离体细胞培养及各项分子生物学技术,阐明醉茄素A心肌细胞保护作用中的分子调节机制,为心梗患者提高介入手术疗效提供实验依据。方法:1.利用实验动物模型模拟人体心梗后冠状动脉再通治疗:小鼠麻醉状态下进行心脏冠状动脉左前降支结扎术,30 min后打开结扎线恢复血液供应,复灌后3 h分离心脏左心室缺血/再灌注区心肌组织用于信号分析,复灌后24 h检测心功能、TUNEL凋亡分析及心肌梗死面积测定。2.实验动物分组伪手术组:除不结扎心脏冠状动脉左前降支外,其余操作同心梗/再灌注组;心梗/再灌注组:小鼠吸入麻醉状态下,行冠状动脉左前降支结扎/再通术;低浓度醉茄素A预处理组:小鼠术前1.5 h腹腔注射1 mg/kg醉茄素A;高浓度醉茄素A预处理组:小鼠术前1.5 h腹腔注射5 mg/kg醉茄素A。3.小鼠心功能测定超声测定心功能:小鼠吸入麻醉状态下,调节探头寻找两侧乳头肌短轴平面,M模式下连续记录三个收缩循环周期的左心室多普勒图像,并计算心功能指标。劲动脉插管测定左心室功能:小鼠吸入麻醉状态下,分离右侧颈总动脉,将带有导丝的探头从动脉微切口缓慢送入左心室,记录左心室压力、左心室舒张末期压力及心率等数值,计算心功能指标。4.心肌梗死面积测定:小鼠心肌缺血后再灌注24 h,使用Evans Blue-TTC染色法将心脏切片染色,计算风险面积百分比。5.TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡:小鼠缺血心肌再灌注24 h,福尔马林固定后制作石蜡切片,TUNEL染色并拍照记录染色结果,计算心肌细胞凋亡率。6.Real Time PCR法检测线粒体凋亡相关蛋白m RNA水平变化:小鼠缺血心肌再灌注3h,提取缺血区心肌组织总RNA,反转录后用Real time PCR法检测线粒体凋亡相关基因m RNA变化。7.Western Blot法检测蛋白表达:小鼠缺血心肌再灌注3 h,提取缺血区心肌组织蛋白,Western Blot法检测蛋白表达改变。结果:1.低浓度(1 mg/kg)醉茄素A显著改善心肌缺血/再灌注损伤1.1超声多普勒法检测小鼠心肌缺血/再灌注模型构建,通过超声图像和心电图结果判定心肌缺血/再灌注损伤模型的建成。1.2心肌缺血/再灌注(MI/R)组小鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)显著低于伪手术(Sham)组(P<0.001),而1mg/kg醉茄素A预处理组的LVEF、LVFS较MI/R组显著增高(P<0.05),5mg/kg醉茄素A预处理组的LVEF、LVFS与MI/R组无统计学差异。1.3血流动力学检测结果显示,MI/R组心室压最大上升速率(+d P/dt max)、心室压最大下降速率(-d P/dt max)显著低于Sham组(P<0.001),而1mg/kg醉茄素A预处理组的+d P/dt max、-d P/dt max较MI/R组显著增高(P<0.05),5 mg/kg醉茄素A预处理组的+d P/dt max、-d P/dt max与MI/R组无统计学差异。1.4 Evans Blue-TTC染色显示,1 mg/kg醉茄素A预处理组的心肌梗死面积较MI/R组显著降低,差异有统计学意义(P<0.001),而5 mg/kg醉茄素A预处理组心肌梗死面积与MI/R组无统计学差异。2.醉茄素A抑制线粒体凋亡降低心肌细胞缺血/再灌注损伤2.1 TUNEL染色显示1 mg/kg醉茄素A预处理组心肌细胞凋亡率显著低于MI/R组(P<0.001),且醉茄素A组Cleaved caspase-3蛋白表达及caspase-3活性也显著低于MI/R组(P<0.001),提示醉茄素A的心肌保护作用依赖醉茄素A抑制缺血/再灌注损伤的心肌细胞凋亡。2.2醉茄素A显著降低线粒体凋亡途径的标志Cleaved caspase-9蛋白表达(P<0.001),而醉茄素A组外源性凋亡Cleaved caspase-8蛋白表达与MI/R组无统计学差异,提示线粒体凋亡是醉茄素A心肌保护作用的关键信号通路;醉茄素A通过促进Bcl-2活性增高,发挥其抑制凋亡作用。2.3醉茄素A抑制线粒体凋亡的作用中,AMPK是关键调节蛋白。3.醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用依赖AMPK活化利用AMPKα2心肌特异性失活小鼠构建心肌缺血/再灌注损伤模型,超声多普勒检测心功能结果显示醉茄素A组LVEF、LVFS与MI/R组相比无差异,而血流动力学检测及Evans Blue染色结果发现醉茄素A组+d P/dt max、-d P/dt max和心肌梗死面积与MI/R组无统计学差异,提示WFA心肌保护作用依赖AMPKα2。4.醉茄素A促进自噬降解维持自噬平衡降低心肌缺血/再灌注损伤4.1与sham组相比MI/R组LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高,醉茄素A组较MI/R组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著降低(P<0.001),而醉茄素A组与MI/R组相比Lamp-2蛋白表达升高、p62蛋白表达降低(P<0.001),提示醉茄素A通过促进自噬降解降低维持自噬平衡。4.2氯喹抑制溶酶体活性后,醉茄素A组LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62蛋白表达均增高,心肌细胞凋亡水平增高。提示,自噬降解异常引起的自噬紊乱促进心肌细胞凋亡增高,而醉茄素A通过促进自噬降解、维持自噬平衡降低心肌细胞凋亡,缓解心肌缺血/再灌注损伤。4.3心肌AMPKα2失活,与MI/R组相比醉茄素A组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著增高,提示AMPKα2是醉茄素A促进自噬降解的关键调节蛋白。结论:1.低浓度(1 mg/kg)醉茄素A可显著改善缺血/再灌注损伤后的心功能,缩小心肌坏死区域面积。2.醉茄素A活化Bcl-2抑制线粒体凋亡、降低心肌细胞凋亡率,发挥心脏保护作用。3.AMPK的活化在醉茄素A抑制缺血/再灌注心肌损伤心肌线粒体凋亡中,起重要调节作用。4.心肌缺血/再灌注损伤中,醉茄素A促进心肌细胞自噬降解,缓解MI/R引起的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高,维持自噬平衡,降低心肌细胞凋亡。