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肾癌是过去十年中发病率和死亡率极高的恶性肿瘤。尽管治疗方式如手术,化疗和放疗在不断进步,但肾细胞癌患者依然从目前的治疗方法中获益甚少。阻碍肾癌治疗进程的主要障碍之一是尚未完全阐明导致肾癌发生发展的潜在的分子机制。因此,研究并阐明涉及肾癌的发生和进展的新基因和调节因子在癌症研究领域中异常关键。Pokemon基因即POK红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid Ontogenicfactor),也被称为LRF,OCZF,FBI-1,在一些人类肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌和淋巴瘤中高表达。Pokemon基因是被第一个发现的ARF的特异性转录抑制物,其可以通过ARF-p53路径对肿瘤发生发展进行调解。Pokemon的作用定位于许多肿瘤抑制基因和原癌基因的上游,可作为肿瘤治疗的一个有效的靶基因。但是关于Pokemon基因在肾癌中发生的作用目前尚未有研究。miRNA已经被公认为癌症起始和进展的关键调节剂。这些非编码RNA是作为致癌基因和肿瘤抑制因子,这取决于它们的目标基因或者特定的肿瘤环境。miR-137是一种已知在胶质瘤和头颈癌的作为肿瘤抑制剂miRNA,在肾癌标本和细胞系中被证明也是下调的。已经证实了 miR-137在体外和体内能够抑制肾癌的生长。然而,miR-137靶向的mRNA分子在肾癌中尚未报道。本课题包括以下三部分:第一部分,检测Pokemon基因在肾癌组织及肾癌细胞系中的表达;第二部分,体外或体内Pokemon基因抑制或过度表达对RCC细胞及正常肾细胞的影响;第三部分,miR-137与Pokemon在肾癌细胞的作用及相关机制的探讨。第一部分Pokemon在肾癌组织及肾癌细胞系中的表达研究方法:1.组织采集:从肿瘤切除的RCC患者那里收集人类RCC组织和癌旁正常肾组织。2.细胞培养:在37℃,含5%二氧化碳孵箱,由ATCC推荐的含10%FBS的适合的培养基中培养人RCC细胞系786-0,ACHN,Caki-1,Caki-2和正常肾细胞系HEK-293细胞。3.通过qRT-PCR检测RCC组织与癌旁正常肾组织之间,RCC细胞系786-0,ACHN,Caki-1,Caki-2和正常肾细胞系HEK-293细胞之间Pokemon mRNA的表达。4.通过Western印迹检测RCC组织和癌旁正常肾组织之间,RCC细胞系786-0,ACHN,Caki-1,Caki-2和正常肾细胞系HEK-293细胞之间的Pokemon蛋白表达。5.统计学分析:采用SPSS进行。差异的统计学意义通过ANOVA或T检验进行分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.与癌旁正常肾组织相比,Pokemon在RCC组织中上调。2.与HEK-293相比,Pokemon在RCC细胞系786-0,ACHN,Caki-1 和Caki-2中上调。结论:Pokemon在RCC组织和RCC细胞系786-0,ACHN,Caki-1 和Caki-2 中上调。第二部分体外或体内Pokemon基因抑制或过度表达对RCC细胞及正常肾细胞的影响研究方法:1.细胞转染用于检测不同载体对细胞的影响。2.MTT法检测细胞增殖情况。3.Transwell实验用于检测细胞的迁移。4.通过抑制Pokemon基因在裸小鼠中建立RCC荷瘤小鼠,监测肿瘤的大小和重量。结果:1.干扰Pokemon基因表达能够抑制RCC的增殖和迁移。2.上调表达Pokemon基因能够增强正常肾细胞的增殖和迁移。3.在体内干扰Pokemon基因时,肿瘤生长被抑制。结论:体外和体内实验均证明Pokemon基因的干扰或过表达调节了肾癌细胞的增殖,迁移。第三部分MiR-137与Pokemon在肾癌细胞的作用及相关机制的探讨方法:1.我们构建了miR-137模拟物和一系列质粒:psiCheck2,psiCheck2-MRE-wt和 psiCheck2-MRE-mut。2.用双荧光素酶报告基因/双荧光素酶(Progema)对萤光素酶测定进行荧光素酶表达水平的定量。结果:1肾癌细胞中Pokemon是miR-137的靶点,miR-137可抑制Pokemon表达。2.Pokemon通过结合其启动子来抑制miR-137的转录。结论:miR-137/Pokemon自动调节循环有助于肾癌细胞的增殖和侵袭。