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目的:分析云南省间日疟患者的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因编码区突变多态及其与伯氨喹诱发性溶血现象之间的相关性;分析人G6PD酶活性降低者中常出现的G6PD基因编码区突变位点,为云南省进一步筛选出G6PD酶活性降低的基因标志奠定基础。方法:(1)收集2018年1月～12月,经“氯喹/伯氨喹八日疗法”治疗的云南省间日疟病例血样184份,本实验采用的样本包括G6PD基因拼接成完整c DNA链的间日疟报告病例样本和外显子exon10～13编码区段的间日疟报告病例样本两部分,以间日疟病例服用伯氨喹初期出现头晕、乏力、腹痛不适,数小时或几天间出现黄疸、尿液呈“茶色”样改变、血红蛋白指征持续降低,NADPH/NADP+比值法测试G6PD酶活性存在任何水平的下降,判断为伯氨喹诱发性急性溶血。(2)从滤纸血样本中提取人基因组DNA使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒,参照DNA提取试剂盒说明书(QIAgen DNA Mini Kit),提取人基因组DNA,巢氏PCR扩增含外显子exon2～13片段的G6PD基因并送测序。测序结果用DNAStar11.0、Bio Edit7.2.5等软件进行整理,将获得的DNA序列与G6PD基因非突变型参比序列、突变型参比序列进行比对并拼接测序序列,确定DNA序列的G6PD基因exon2～exon13外显子区域的起止点,并将这12个外显子的DNA序列沿exon2至exon13的顺序拼接成G6PD基因的c DNA序列。(3)用MEGA5.04软件对c DNA链和外显子exon10～13编码区段进行文件格式调整和氨基酸转换,并与非突变型序列比对分析以确认错义突变、同义突变位点。用Dna SP5.10软件对G6PD基因片段的单倍型期望杂合度(Expected heterozygosity,He)、核酸多样性指数(π)、同义替代率(Ks)和异义替代率(Ka)比值,即Ka/Ks比值,进行计算分析。(4)用统计学中IBM?SPSS?21软件的“交叉列表”程序对G6PD基因编码区位点突变与伯氨喹诱发性溶血出现的相关性系数(Relevance,R)、比值比(Odds ratio,OR)进行分析计算。结果:(1)本研究收集云南省间日疟报告病例G6PD基因血样共184份,获得间日疟报告病例血样的G6PD基因完整c DNA链(长度为1545bp)的样本44份,其中1条来自溶血病例的G6PD基因组;获得间日疟报告病例血样的G6PD基因部分外显子exon10～13(长度为495bp)样本91份。44条c DNA链与非突变型序列比对的突变位点包括c.461T>A、c.574C>T、c.786C>T、c.1059 C>T、c.1311T>C和c.1376 G>T,频率分别为1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、47.1/10万和1.5/10万。91条外显子exon10～13的部分G6PD基因片段与突变型序列比对出的突变位点为c.1311T>C,未检测出与伯氨喹诱发性溶血发生为正相关性的突变位点c.1376 G>T,突变位点为c.1311T>C的频率为168.72/10万。(2)c.1311与c.1376的双位点突变连锁仅存在于1例溶血病例的基因组,且c.1376位点突变与伯氨喹诱发性溶血的发生为正相关性(R=1.000,P?0.05)。(3)44条c DNA链定义为6种单倍型(Hap＿1～Hap＿6),He、π、Ka/Ks分别为0.493、0.001和0.062;c.1311单点突变的Hap＿2单倍型占比最多,为68.2%(30/44),等位组成亦最复杂,出现非突变半合子(6/44,13.6%)、突变半合子(17/44,38.6%)、非突变纯合子(5/44,11.5%)、突变纯合子(11/44,25%)、突变杂合子(5/44,11.4%)等5种类型合子。Tjima’s中性检验D值为-1.414(P>0.10),且全段的D值均<1,表明研究序列检出的突变不属于定向选择压力下的非中性突变,Ka/Ks比值为0.062,说明研究序列非常保守、错义突变率低于同义突变率。(4)91条c DNA链定义为2种单倍型(Hap＿1～Hap＿2),He、π分别为0.2784、0.001和0.001;c.1311单点突变的Hap＿2单倍型占比最多,为83.5%(76/91),等位组成亦最复杂,出现非突变半合子(12/91,13.2%)、突变半合子(56/91,61.5%)、非突变纯合子(3/91,3.3%)、突变纯合子(18/91,19.8%)、突变杂合子(2/91,2.2%)等5种类型合子。Tjima’s中性检验D值为0.48503(P>0.10),但其D值<1,说明所研究序列检出的突变不属于平衡选择压力下的非中性突变。G6PD基因外显子核苷酸变异不受选择压力作用,或受选择压力的影响不大,符合中性突变假设。结论:1.本实验样本共从44例G6PD全基因中检测出6种突变位点,3种为同义突变,另3种引起氨基酸变异,其中,c.461、c.574和c.786为新发现的3个位点的碱基替换突变类型。2.通过对云南地区1例疑似伯氨喹诱发溶血的间日疟病例G6PD基因突变型进行分析,c.1311与c.1376的双位点突变连锁仅存在于溶血病例的基因组,研究发现,c.1376位点的突变与伯氨喹诱发性溶血的发生有关。仅c.1376位点的G>T突变与氧化剂诱发性溶血的发生呈正相关关联性(R=1.000,P?0.05)。3.本研究的44例全基因样本中有32例c.1311位点发生突变,91例G6PD基因外显子exon10～13样本中有76例c.1311位点发生突变。说明在云南省疟区人群中,c.1311为G6PD基因外显子exon11编码区的常见突变位点,G6PD基因外显子exon11是外显子exon 2～13编码区中基因易突变的高发区。4.44例样本中,共鉴定出8种突变基因型,18例半合子3种突变基因型(461、1311、1376),6例杂合子2种突变基因型(786、1311),13例突变纯合子3种突变基因型(574、1059、1311)。5.本研究利用优化设计的引物和PCR技术,扩增出了G6PD基因外显子全长为1545bp的全基因编码序列,为分析G6PD基因外显子的多态性奠定了基础。