抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）广泛存在于土壤、水体及空气等不同环境介质中，并威胁到人类健康和公共卫生安全。新鲜畜禽粪便中含有大量抗性细菌和抗性基因，直接施用会增加农田土壤中抗性基因的丰度，被认为是抗性基因进入土壤环境的主要途径。好氧堆肥发酵是畜禽粪便无害化处理的主要方式，有研究表明新鲜畜禽粪便经堆置或好氧堆肥发酵后其ARGs数量和种类减少。但是，少量的抗性基因或抗性细菌进入土壤环境仍然存在一定的风险，而且长期施用堆肥发酵制成的有机肥对土壤抗性基因的影响尚未可知。鉴于此，本研究利用江苏常熟长期施用新鲜猪粪和发酵猪粪定位试验地平台，以四环素抗性基因(tetracycline resistance genes，TRGs)为切入点，靶标在不同环境中被多次报道的23种TRGs，采用定量PCR(qPCR)、克隆文库、高通量测序和实验室模拟施肥等方法，通过比较施用高量（9.0t/ha）和低量(4.5t/ha)新鲜猪粪以及发酵猪粪6年后土壤中TRGs的种类、数量和多样性的差异，揭示连续施用粪肥对水稻土中TRGs的影响;并进一步通过土壤剖面和室内培养方法探讨影响土壤抗性细菌和抗性基因的因素和机制。　　本研究的主要结果如下:　　1、通过PCR方法对新鲜猪粪和发酵猪粪以及各自施用土壤和不施肥土壤中的TRGs种类进行定性检测。研究发现，新鲜猪粪中可检测到21种TRGs，而发酵猪粪中可检测到的TRGs种类相对较少（12种）。在连续施用新鲜猪粪和发酵猪粪的土壤中共检测到9种TRGs，包括tet(P)、tetO、tetS、tetW、 tetC、tetG、tetZ、tetL和tetX。通过比较发现，新鲜猪粪和发酵猪粪施用均带入了tetO到土壤中，而其它8种TRGs则在施肥前就已在土壤中存在。与新鲜猪粪相比，发酵猪粪并没有改变土壤中可以检测到的TRGs种类。　　2、进一步采用qPCR方法对土壤中检测到的8种TRGs进行了定量分析，结果表明，施用新鲜猪粪和发酵猪粪后土壤中的tetG、tetL和tet(P)的绝对数量和相对数量均明显增加;但与施用新鲜猪粪相比，施用等干重发酵猪粪的土壤中8种TRGs的相对数量总和并没有减少，最主要的抗性基因也同是tetG、tetZ、tetL和teB(P)，而且除了含有同等数量的tetZ和tetS以外，tetG和tetL的相对数量甚至增加。因此，与直接施用新鲜猪粪相比，连续施用发酵猪粪并没有降低猪粪对土壤TRGs数量增加的风险。　　3、在揭示TRGs数量变化的同时，通过构建克隆文库的方法，分析了新鲜猪粪、发酵猪粪以及连续施肥土壤中tetG和tetL基因的多样性。结果表明，在新鲜猪粪、发酵猪粪以及施肥土壤中均含有多种tetG和tetL基因型，其中一些基因型序列与Genbank中动物病原菌携带的相应抗性基因序列相似度高达98％～100％，说明这些基因可能是由粪肥中的病原菌携带。虽然与新鲜猪粪相比，发酵猪粪含有相同的tetL多样性和更高的tetG多样性，但与连续施用新鲜猪粪的土壤相比，连续施用发酵猪粪的土壤中tetG和tetL多样性显著降低，且主要基因型G1和L1在整个基因文库中所占的比例显著增加。　　4、在揭示了土壤TRGs数量和多样性的变化基础上，进一步通过相关性分析方法，探讨了土壤物理化学因素以及微生物功能多样性与TRGs、四环素抗性细菌之间的关系。土壤中tetG、tetL、tetZ和tetB(P)的绝对数量以及四环素抗性细菌数量（包括绝对数量和相对数量）与土壤全N、OM、碱解N、全P、速效P、CEC、＜2μm颗粒百分比、2mm～50μm颗粒百分比、速效K、以及微生物功能多样性等均有显著正相关性;但与土层深度、50～2μm颗粒百分比、pH和全K呈负相关。而tetL、tetB(P)、tetG的相对数量与上述环境因素的相关性则正好相反。由此可知，土壤中TRGs的存留和扩散是多种因素共同作用的结果。　　5、为了解析施用粪肥增加土壤四环素抗性的机制，采用室内培养方法分析了新鲜猪粪和灭菌新鲜猪粪添加之后土壤中可培养四环素抗性细菌和抗性基因的动态变化。结果表明，添加灭菌猪粪的土壤中四环素抗性细菌没有显著增加，说明粪肥中的养分以及不被活体细菌携带的胞外TRGs对土壤中抗性细菌数量的增加并无显著贡献，而新鲜猪粪中抗性细菌的存活和繁殖以及抗性基因的扩散可能是主要原因，土壤TRGs的增加是多次施用猪粪后在土壤中累积的结果。此外，土壤微生物群落对粪肥中携带的抗性细菌在土壤中的繁殖过程中发挥了重要的抑制作用。　　综上所述，本研究深入解析了稻麦轮作模式下连续施用发酵猪粪和新鲜猪粪对水稻土中四环素抗性基因的影响及其机制;证明了四环素抗性基因和抗性细菌在土壤中的存留和扩散是多种因素共同作用的结果，其中土壤全N和有机质含量等与土壤四环素抗性基因以及抗性细菌的相关性最大;但是粪肥施用后土壤抗性细菌在短时间内显著增加的主要原因是由猪粪中抗性细菌的存活和繁殖引起，与粪肥中的养分无关。本研究为畜禽粪便发酵生产有机肥及农田施用猪粪的风险评估研究提供了理论依据和技术参考。