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双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒,已在多个国家和地区的经济作物上造成严重危害。越来越多的双生病毒被报道伴随有betasatellite和alphasatellite,所有的betasatellite在其互补链上都编码一个保守的βC1ORF,而所有的alphasatellite在其病毒链上都编码一个复制相关蛋白Rep。本文通过农杆菌介导的瞬时和转基因表达的方法,对赛葵黄脉病毒伴随betasatellite (Malvastrum yellow vein betasatellite, MYVB)、中国番茄黄曲叶病毒伴随betasatellite (Tomato yellow leaf curl China betasatellite, TYLCCNB)以及烟草曲茎病毒伴随alphasatellite (Tobacco curly shoot alphasatellite, TbCSA)的启动子相继进行了鉴定,并初步研究了卫星启动子对病毒复制和致病性的影响。通过荧光光度法对MYVB βC1基因上游全长非编码区(991nt)进行了分析,瞬时表达结果表明991nt的片段具有启动子活性,是花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)35S启动子活性的29%。利用缺失突变的方法在MYVB PCI基因上游390nt到418nt的位置鉴定了一个对启动子活性具有重要调控作用的5UTR Py-rich stretch元件,该元件的缺失使得βC1基因的启动子活性下降到CaMV35S启动子活性的11%。进一步构建了缺失5UTR Py-rich stretch的MYVB病毒侵染性克隆,以赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus, MYVV)为辅助病毒,将突变体和野生型卫星分子分别先后侵染本氏烟叶盘和接种植株,Southern blot结果表明5UTR Py-rich stretch的缺失使得卫星分子的积累量有明显下降,分别下降为野生型的61%和62%,但是对病毒诱导的症状表型没有显著影响。通过荧光光度法和组织化学法对TYLCCNB-Y25βC1基因上游全长非编码区(982nt)进行了分析,结果表明982nt的片段表现CaMV35S启动子活性的44%,并且驱动GUS基因在转基因普通烟草中组成型表达。将982nt的片段串联后,瞬时表达结果表明GUS荧光活性提高到CaMV35S启动子的59%左右。鉴于之前的报道显示TYLCCNB-βC1启动子为韧皮部特异性表达,我们的结果证实双生病毒伴随的同一个卫星分子的不同分离物的βC1启动子在表达活性和表达模式上可能存在差异。侵染性分析实验显示,以中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)为辅助病毒时,TYLCCNB-Y25在本氏烟、三生烟、心叶烟以及番茄等寄主上能够引起曲叶症状,而TYLCCNB-Y10除引起曲叶外还能引起耳突、黄脉及茎秆扭曲等症状。为了明确βC1启动子的表达模式是否与症状相关,通过overlap extension PCR的方法对上述两个卫星分子βC1基因上游的全长非编码区(即启动子区)及βC1基因上游约200nt的片段(简称为片段PP, part promoter)进行了互换,构建嵌合体卫星的侵染性克隆,与辅助病毒TYLCCNV共同接种本氏烟。结果表明,嵌合有TYLCCNB-Y25启动子的TYLCCNB-Y10重组卫星分子跟野生型TYLCCNB-Y10类似,在寄主上诱导产生耳突和茎秆扭曲的症状；而嵌合有TYLCCNB-Y10启动子的TYLCCNB-Y25重组卫星分子在寄主上却仅诱导曲叶的症状,与野生型TYLCCNB-Y25类似。同样,互换PP区段的嵌合体卫星几乎未对病毒诱导症状表型产生影响。以上结果说明TYLCCNV伴随不同卫星分子编码的pC1蛋白对症状诱导起决定性作用,启动子对症状差异影响较小。为了明确症状差异的较小决定因子,进一步利用overlap extension PCR的方法构建了βC1三个区段(C末端,M部分,N末端)的嵌合体卫星分子,分别构建嵌合体卫星侵染性克隆,以TYLCCNV为辅助病毒接种本氏烟,结果发现,嵌合有TYLCCNB-Y10βCl的C末端部分的TYLCCNB-Y25分子获得了诱导耳突和茎秆扭曲的能力,但耳突的数量和大小都有所减少或变小,说明TYLCCNB-Y10αCl的C末端部分是诱导耳突和茎秆扭曲等表型所必需,而pcl的其他区段也能影响症状诱导。利用GUS报告基因对TbCS A Rep基因翻译起始位点上游420nt的片段进行了瞬时和转基因表达分析,结果表明,420nt片段的平均相对GUS活性是CaMV35S启动子的18%,并且在转基因烟草中组成型表达。通过缺失突变的方法发现,5’端缺失的系列启动子表达载体表现高低不同的活性,其中215nt的片段具有基础启动子活性,227nt片段表现与420nt片段相一致的活性；而3’端缺失56nt的片段基本丧失了启动子活性。