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旋毛虫病是由旋毛形线虫(Trichinella spiralis)引起的一种危害严重的人兽共患线虫病,旋毛虫病对畜牧业及人类健康造成了严重危害,是目前世界范围内投入防控费用最高的食源性人兽共患寄生虫病之一。人和动物感染旋毛虫病主要是因为富含肌幼虫包囊的肉被其吞食导致。包囊在胃酸的作用下,释放出感染性肌幼虫,肌幼虫经数小时后钻入小肠,在小肠内产生新生幼虫继续其下一阶段生活史。旋毛虫的致病过程类似于大肠杆菌进入机体要经过胃部极酸性环境。近年来,关于致病性大肠杆菌抗酸系统的研究成果尤为显著。加强对旋毛虫病的检验与诊断,是控制该病的唯一有效途径。本研究利用siRNA干扰技术抑制旋毛虫TsGAD基因的表达,进而研究谷氨酸依赖型抗酸系统在旋毛虫抗酸机制中作用。同时,以旋毛虫的谷氨酸脱羧酶(TsGAD)、谷氨酰胺酶(TsGLS)为包被抗原成功建立两种间接ELISA方法。本研究根据NCBI已发表的TsGAD mRNA序列,设计3条靶向沉默TsGAD的干扰序列siRNAs:GAD-siRNA1、GAD-siRNA2和GAD-siRNA3及一条阴性对照:control siRNA。通过浸染法在Lipofectin 2000的作用下将siRNAs导入旋毛虫体内,利用免疫荧光技术确定转染时间为12 h。应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术、Western blot(WB)技术检测RNA干扰技术对TsGAD基因表达量的影响。qPCR和WB的结果显示,三条siRNAs序列均能抑制TsGAD基因的表达,其中GAD-siRNA1序列对TsGAD基因的抑制效果最好,抑制率为51.70%~56.70%。同时,通过qPCR和WB实验确立siRNA最适转染浓度为2μM。体外酸性环境培养TsGAD基因沉默的旋毛虫,从TsGAD基因的表达量、TsGAD酶活性、虫体存活率和培养基pH值变化等方面研究旋毛虫的抗酸机制。研究结果表明,酸性环境可以诱导TsGAD基因的表达,相同pH条件下,干扰组的酶活性比PBS组低;酸性条件下酶活性高。在同一pH值的培养液中,随着培养时间的增加,各组旋毛虫的存活率降低;在pH 6.6时各组旋毛虫的存活率最高;相同培养时间和相同pH下,GAD-siRNA1组旋毛虫的存活率明显低于PBS组。GAD-siRNA1组与PBS相比,培养基pH值升高不明显。用TsGAD基因沉默后的旋毛虫感染小鼠,从旋毛虫成虫的减虫率、RCI、LPG、肌幼虫减虫率和肌幼虫保姆细胞壁的厚度等方面研究TsGAD基因沉默后的旋毛虫感染小鼠的能力。研究结果显示,与PBS组相比,GAD-siRNA1组成虫减虫率为31.50%,RCI为62.51±7.32,LPG为1250.22±146.48;肌幼虫的减虫率为49.15%;F1代保姆细胞壁增厚,周围有大量炎性物质。以上研究结果揭示,TsGAD基因在旋毛虫抗酸过程中起到非常重要作用。将TsGAD基因沉默后旋毛虫的F1代肌幼虫酸性条件下培养,研究结果为F1代肌幼虫在pH 2.5的培养基中培养2 h后的存活率为57%,与F0代旋毛虫的存活率差异显著,说明siRNA的干扰效果不可以延续给下一代。本研究分别以旋毛虫TsGAD、TsGLS重组蛋白作为包被抗原,建立两种检测旋毛虫血清抗体的间接ELISA方法。分别对抗原包被量、血清稀释度、抗原包被条件、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TMB作用时间等条件进行了优化。研究结果显示TsGAD重组抗原间接ELISA方法的最适抗原包被量为50 ng,最适血清稀释度为1:200,最适抗原包被条件为4℃过夜包被,最适封闭液为5%脱脂乳,最适封闭时间为37℃封闭2 h,酶标二抗的最适稀释度为1:5000,最适孵育时间为37℃封闭1 h,TMB作用时间为15 min;TsGLS重组抗原间接ELISA方法的最适抗原包被量为100 ng,最适血清稀释度为1:800,最适抗原包被条件为4℃过夜包被,最适封闭液为5%脱脂乳,最适封闭时间为37℃封闭2 h,酶标二抗的最适稀释度为1:5000,最适孵育时间为37℃封闭1 h,TMB作用时间为15 min。TsGAD重组抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值判定标准为0.848,TsGLS重组抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值判定标准为0.963。通过重复性实验、敏感性实验、特异性实验和对比实验检测了本研究建立的两种间接ELISA方法的准确性。研究结果显示,TsGAD重组抗原间接ELISA方法批内重复性实验的最大变异系数为5.647%,批间重复性实验最大变异系数6.049%,均小于10%,重复性好;当旋毛虫阳性血清稀释3200倍时,测得P/N值大于2.1,显示阳性,表明敏感性高;对猪蛔虫、华支睾吸虫、血吸虫和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有很好的稳定性和特异性。TsGLS重组抗原间接ELISA方法批内重复性实验的最大变异系数为7.318%,批间重复性实验最大变异系数8.536%,均小于10%,重复性好;当旋毛虫阳性血清稀释3200倍时,测得P/N值大于2.1,显示阳性,表明敏感性高;对猪蛔虫、华支睾吸虫、血吸虫和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有很好的稳定性和特异性。同时用膈肌压片法、两种间接ELISA方法和旋毛虫抗体快速检测卡分别对旋毛虫感染不同剂量和天数的小鼠进行检测,研究结果表明,旋毛虫感染剂量越多,旋毛虫病越早被检测出且检出率越高。无论旋毛虫感染剂量的多少,膈肌压片法最早可在旋毛虫感染后的第21天检测出旋毛虫病,这与旋毛虫的生活史有关;TsGAD重组抗原间接ELISA方法和TsGLS重组抗原间接ELISA方法最早在感染后的第7天检测出感染剂量为30条的旋毛虫病;旋毛虫快速检测卡最早可在感染后的第14天检测出感染剂量为30条的旋毛虫病。TsGAD重组抗原间接ELISA检测方法和TsGLS重组抗原间接ELISA检测方法对于心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器研磨液的检测结果相似:在不同的旋毛虫感染剂量下均是最先从心脏研磨液中检测出;同一脏器研磨液的检出率随着感染剂量和感染天数的增加而升高。本研究利用RNA干扰技术成功的抑制了TsGAD基因的表达;实验结果证明旋毛虫谷氨酸脱羧酶在其耐受胃酸环境时发挥了重要作用,为后续研究提供了基础数据。同时,建立的两种间接ELISA方法为旋毛虫病的早期诊断和流行病学调查提供了必要的检测手段。