基因治疗是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内,使之表达目的基因产物,从而疾病可以得到治愈,这是现代分子生物学的理论和技术相结合的范例。“基因增补”是目前唯一可以成功实现的基因治疗方案,也就是不去除异常的基因,而是通过导入外源基因来表达正常产物,达到补偿缺陷基因的目的。当前基因治疗研究中急需解决的问题是如何设计安全高效的基因转运载体。介于目前导入基因的手段不理想,就基因治疗的发展趋势而言,非病毒性基因载体受到科研者更多的关注。超电荷绿色荧光蛋白（Supercharged green fluorescent protein,Sc GFP）是一种表面带有很高净电荷的新型功能性荧光蛋白,通过遗传修饰等手段对超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein,sf GFP）进行表面重构后获得。它具有很好的水溶性,带正电荷的Sc GFP能够高效地穿透细胞膜,并运载核酸和蛋白质等生物大分子进入哺乳动物细胞内。与传统的转运载体相比,Sc GFP具有细胞毒性低,转运效率高和广泛的细胞普适性等优点。但是,Sc GFP的穿膜作用对细胞不具有选择性,载体不能实现靶向运载核酸。比如肿瘤细胞生长需要一个微酸的外部环境,而正常细胞一般在中性pH条件下生长。我们希望载体能够定位于肿瘤细胞而非正常细胞,这就促使我们渴望拥有一种对外界环境做出智能响应型的载体。H₃₉GFP是一种新型的智能型绿色荧光蛋白,通过进一步对Sc GFP的表面进行重构,把Sc GFP表面的精氨酸和赖氨酸替换成组氨酸,构建出了这种新型的绿色荧光蛋白(H₃₉GFP)。H₃₉GFP除了具有上述Sc GFP相同的特点以外,我们的实验发现,由于H₃₉GFP的一级结构中包含了39个组氨酸残基,它的表面净电荷可以进行人为的调控。因此,本文开发了一个基于表面重构荧光蛋白H₃₉GFP的智能响应型核酸载体,主要研究工作如下:（1）H₃₉GFP的基因克隆以及蛋白的表达纯化。从H₃₉GFP的氨基酸残基序列反推出H₃₉GFP的基因序列（h39gfp）,并结合大肠杆菌偏好的密码子系统对序列进行优化。通过全基因人工合成的方式获得携带H₃₉GFP基因序列的质粒p UC19-h39gfp。通过“一锅法”获得用于表达的重组质粒p ET28-h39gfp。将重组质粒p ET28-h39gfp转入大肠杆菌中,诱导表达H₃₉GFP。在AKTA purifier蛋白纯化系统上通过Ni-NTA柱和脱盐柱对目标蛋白进行纯化,获得了高纯度的有活性的H₃₉GFP。用聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外吸收光谱和荧光光谱等手段对目标蛋白进行了表征。（2）H₃₉GFP表面电荷的性质,及其与DNA之间相互作用的研究。通过荧光成像和Zeta电位的表征,证实了H₃₉GFP的表面电荷是可以通过pH值和Ni²⁺进行调控的,发现在微酸环境（pH 5.0）或者Ni²⁺存在的情况下,H₃₉GFP的表面带正电。原子力显微镜对不同条件下的H₃₉GFP/DNA（30个核苷酸的单链DNA）混合物进行表征,发现H₃₉GFP的表面带正电的情况下,H₃₉GFP/DNA形成了直径在数百纳米（亚微米级别）的复合体颗粒。形成H₃₉GFP/DNA纳米复合体后,H₃₉GFP被包裹到H₃₉GFP/DNA纳米复合体中,由于H₃₉GFP分子间发生homo-FRET,H₃₉GFP的荧光各项异性显著地降低。当DNA被标记上猝灭基团时,H₃₉GFP/DNA纳米复合体中H₃₉GFP的荧光被高效地猝灭。（3）简单逻辑门的构建。根据H₃₉GFP的表面电荷可通过pH和Ni²⁺调控的特点以及H₃₉GFP/DNA之间的静电相互作用,以溶液pH值的变化、Ni²⁺的浓度变化或DNA作为逻辑门的输入信号,将H₃₉GFP的荧光猝灭率作为逻辑门的输出信号,实现了“或”门、“抑制”门和“与”门。（4）基于H₃₉GFP的智能响应型核酸载体。利用激光共聚焦显微镜观察在不同条件下细胞内H₃₉GFP的绿色荧光和DNA所标记的红色荧光,以此来反映H₃₉GFP运载核酸的能力,发现只有在微酸环境或者Ni²⁺存在的情况下,H₃₉GFP才能够有效的将DNA运载进入细胞。因此H₃₉GFP作为核酸载体可以实现智能运载的目的。同时利用流式细胞仪半定量检测了细胞中H₃₉GFP和DNA的荧光强度,以此推算了H₃₉GFP的运载效率。