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基因治疗在肿瘤治疗中展现出广阔的前景。其中,肝癌的自杀基因研究取得了一定进展,是一种较为有效和具有临床应用潜力的基因疗法,但治疗的效果不太令人满意,基因的联合治疗有望成为肝癌治疗的新耙点。目前联合基因治疗最常用的是有单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus.thymidine kinase,HSV-TK)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E coli cytosine deaminase,CD)。同时,肿瘤的基因治疗要求导入的自杀基因表达严格限制于靶细胞(肿瘤细胞),而对正常细胞的生长无影响,因此寻找肿瘤细胞的靶点成为亟待解决的现实问题。端粒酶是维持端粒长度的一种逆转录酶,对细胞增殖、衰老及永生化和癌变起重要作用。现已证实端粒酶在85%以上的肿瘤细胞中呈现阳性表达,在几乎所有的成人体细胞中呈现阴性。在端粒酶的三个亚单位中hTERT(端粒酶逆转录酶)是其活性的关键限速步骤,因而hTERT启动子将成为基因靶向表达的理想开关。已有研究证实CD、TK自杀基因治疗肿瘤已取得了初步成效,但是二者联合应用,尤其是在hTERT启动子特异调控下靶向抗肝癌,研究尚少,本研究旨在观察评价hTERT启动子驱动下的联合自杀基因体系对肝癌细胞靶向高效表达。目的:观察hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-Fc对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的靶向杀伤效应,以及联合作用后对药物浓度的影响。方法:1.细胞培养;2.构建pGL3-hTERT-CD质粒;3. hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-Fc同时转染HepG2细胞和正常肝细胞L-02;4.用MTT法观察药物浓度对肝癌细胞存活率的影响;5.用流式细胞仪技术观察自杀基因对肝癌细胞生长和凋亡的影响;6.用TUNEL观察自杀基因对肝癌细胞生长和凋亡的影响,以及对旁观者效应的观察。结果:1. MTT法显示hTERT启动子的驱动下两自杀基因体系可以协同表达于肝癌细胞,当GCV为20μg/ml,5-FC为200μg/ml时,对HepG2细胞的杀伤作用达到最大。2.流式法显示hTERT启动子分别驱动两自杀基因体系与单独的TK自杀基因表达于肝癌细胞HepG2,肝癌细胞总的凋亡率分别为82.43%和63.37%,而正常肝细胞L-02的凋亡率仅为17.42%和14.62%,几乎不影响正常肝细胞的生长;3. TUNEL法显示在肝癌细胞中,自杀基因被启动子高效表达,产生凋亡小体和明显的细胞凋亡率,转染正常肝细胞无此现象。结论:hTERT-TK/GCV联合hTERT- CD/5-Fc基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,存在明显的旁观者效应,弥补了基因治疗转染效率不高的问题,便于指导今后的实验和研究。