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第一章美洲人参水提取物在小鼠心肌缺血再灌注中的心脏保护作用及机制研究研究背景内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是体内重要信号分子一氧化氮(NO)的主要生理学来源。研究报道,由eNOS产生的NO可通过抑制心肌凋亡而减轻心肌缺血再灌注损伤。NO的抗凋亡作用与减轻氧化应激和抑制caspase的激活有关。PI3-kinase/Akt信号通路的激活可上调心肌细胞eNOS的表达和活性。人参(ginseng)是全世界应用最广的药草之一,主要包括亚洲人参(Asian ginseng or Panax ginseng C.A. Meyer)和美洲人参(American ginseng or Panax quinquefolius Linn),其主要活性成分是人参皂苷(ginsenosides)。人参具有广泛的药理学作用,包括降血压,降血糖和抗氧化等。在心血管系统,人参可促进NO的释放,舒张血管和改善脂质新陈代谢,常用于治疗高血压和心脏衰竭。研究报道,人参皂苷可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。另有研究表明,人参皂苷可激活离体大鼠心脏PI3-kinase/Akt/eNOS信号通路。依据PI3-kinase/Akt/eNOS通路与心肌缺血损伤密切相关,以及人参皂苷可影响该信号途径,我们推测美洲人参水提取物减轻心肌缺血再灌注损伤可能与上调PI3-kinase/Akt/eNOS通路及抑制心肌凋亡有关。方法动物实验野生型C57BL/6小鼠口服美洲人参水提取物(以下简称人参)7天,分别在第0(对照)、1、3、5和7天收集心肌,检测心肌Akt、磷酸化Akt、eNOS和a-actinin蛋白表达(Western Blot)。此外,野生型和eNOS基因缺陷小鼠口服人参7天后,利用心脏冠状动脉左前降支结扎建立心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)模型。采用Evans blue灌注和TTC染色评价心肌梗死大小；取梗死边缘区心肌检测心肌凋亡水平(caspase-3分析试剂盒和ELISA)细胞实验分离和培养出生后24h内的野生型和eNOS基因缺陷新生小鼠心肌细胞。不同浓度的人参孵育心肌细胞24h后,检测心肌细胞Akt、磷酸化Akt、eNOS和a-actinin蛋白表达(Western Blot)。利用缺氧再给氧(anoxia-reoxygenation, A/R)模型模拟在体缺血再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡,随后检测心肌细胞caspase-3的活性(caspase-3分析试剂盒)和胞浆DNA断片(ELISA)评价心肌细胞凋亡水平。结果小鼠口服人参7天后有显著上调的心肌Akt活性和eNOS蛋白表达；阻断PI3-kinase/Akt通路可抑制人参诱导的eNOS表达。与对照组相比,人参预处理7天显著抑制缺血再灌注诱导的心肌梗死和凋亡,而eNOS基因缺陷或利用LY294002阻断PI3-kinase/Akt通路均可取消人参的心脏保护作用。与对照组相比,人参预处理可显著上调心肌细胞Akt活性和eNOS蛋白表达；PI3-kinase/Akt通路抑制剂LY294002可阻断人参诱导的eNOS表达；此外,人参也可增加缺氧再给氧损伤时心肌细胞eNOS的蛋白表达。人参预处理心肌细胞24h可显著抑制缺氧再给氧诱导的细胞凋亡,这种抗凋亡作用在eNOS基因缺陷或LY294002预处理的心肌细胞中可完全取消。结论美洲人参水提取物减轻心肌缺血再灌注损伤与抑制心肌细胞凋亡有关,其机制是通过PI3-kinase/Akt/eNOS途径所介导。本研究结果为将美洲人参进一步开发为抗心肌缺血损伤药物提供了实验依据。第二章美洲人参水提取物在LPS诱导的小鼠内毒素血症中的心脏保护作用及机制研究研究背景败血症(sepsis)是血液微生物感染引起的全身炎症反应综合征是ICU危重病人的主要死亡原因之一。败血症病人常伴有心肌抑制,导致心脏功能受损。革兰阴性菌的细胞壁成分LPS或内毒素是导致败血症心肌抑制的主要病原体。促炎细胞因子的释放介导了LPS诱导的心功能受损,其中TNF-α是关键的细胞因子之一。败血症时心肌TNF-α主要来源于心肌细胞。最近研究发现,败血症时心肌细胞ERK1/2的活化可促进TNF-α的表达,提示ERK1/2是败血症时TNF-α产生的上游信号。人参可抑制多类细胞TNF-α的表达和释放,并阻断ERK1/2的活化。基于ERK1/2和TNF-α是LPS诱导心肌损伤的重要介导物,以及人参对这些介导物的抑制作用。因此,本研究在LPS诱导的小鼠内毒素血症模型,观察了美洲人参水提取物对心脏功能的保护作用,并探讨了其机制(ERK1/2-TNF-α途径)方法动物实验成年野生型C57BL/6小鼠口服美洲人参水提取物(以下简称人参)5天后腹膜腔内注射LPS诱导内毒素血症,相同周龄野生型小鼠作为对照。LPS注射后4h监测小鼠心脏功能。另取一批小鼠口服人参5天后腹膜腔内注射LPS,在不同时间点收集血浆和心肌,分别检测血浆TNF-α浓度(ELISA)、心肌TNF-αmRNA (real-time PCR)和蛋白水平(ELISA),以及ERK1/2的磷酸化表达(Western Blot)。细胞实验收集出生后24h内的野生型C57BL/6小鼠,分离和培养心肌细胞。不同浓度的人参提取物孵育细胞48h后加入LPS处理不同时间,收集培养上清和心肌细胞,分别检测上清TNF-α浓度(ELISA),心肌细胞TNF-αmRNA表达(real-time PCR)和磷酸化ERK1/2蛋白表达(Western Blot)结果侵入性心功能监测结果显示人参可改善LPS诱导的心功能异常,促进各项心功能指标恢复。与对照组相比,小鼠口服人参5天显著抑制LPS诱导的血浆TNF-α水平、心肌TNF-αmRNA和蛋白水平,以及心肌ERK1/2的活化；人参孵育细胞48h可剂量依赖性抑制LPS诱导的心肌细胞TNF-α的释放,下调TNF-αmRNA的表达,以及降低磷酸化ERK1/2的蛋白水平。结论在LPS诱导的小鼠内毒素血症,美洲人参水提取物对心脏功能有保护作用,其机制可能与抑制心肌细胞ERK1/2-TNF-α通路有关。本研究为进一步将美洲人参开发为败血症时心脏保护药物提供了实验依据。