研究背景糖尿病心血管并发症是糖尿病患者的主要死亡原因之一,并呈现逐年增加的趋势。糖尿病性心肌病是糖尿病心血管并发症中的重要一员,它指的是发生于糖尿病患者(包括1、2型),不可以用冠心病、高血压性心肌病等其他原因解释的心肌疾病。糖尿病性心肌病的诊断目前尚无一个统一的标准。其特点是心肌结构和功能异常,例如左心室舒张和收缩功能障碍和心肌显著的间质纤维化。糖尿病性心肌病进一步进展可导致患者心力衰竭和心律失常等,重症者甚至死亡。及时有效地治疗糖尿病性心肌病对降低糖尿病患者的死亡率有着积极的意义。然而,目前临床上并没有可以有效地治疗糖尿病性心肌病的药物。利拉鲁肽是一种人胰高血糖素样肽-1类似物,现已在临床上用于治疗2型糖尿病。临床与实验研究表明,人胰高血糖素样肽-1类似物具有心血管保护作用,例如改善冠状动脉缺血患者的心肌功能以及减缓动脉粥样硬化的病变。然而,利拉鲁肽对糖尿病性心肌病是否同样具有保护作用及其潜在的作用机制尚未阐明。自噬是细胞内的一种用来维持细胞内稳态的“自我消化”的途径。自噬既可降解细胞内错误折叠或变性的蛋白质及其聚合物,也可降解受损的线粒体等细胞器。自噬被认为是一个动态的过程,被称作为“自噬流”。有研究表明,自噬在糖尿病性心肌病的病变发生发展中起到一定作用。利拉鲁肽可促进肝细胞和胰岛β细胞内的自噬水平从而增加细胞活性,但是目前尚未证实利拉鲁肽可通过促进心肌细胞内的自噬流水平而产生心肌保护作用。另外,AMPK是一个经典的自噬上游信号调节通路,AMPK信号通路受到抑制可引起自噬水平的下降。有研究报道,利拉鲁肽可激活骨骼肌细胞和肝细胞内的AMPK信号通路。因此,我们提出假设:利拉鲁肽可通过激活AMPK信号通路促进心肌细胞自噬流从而减轻糖尿病性心肌损伤。研究目的1.在肥胖Zucker大鼠糖尿病动物模型及原代心肌细胞高糖模型中,证实利拉鲁肽可减轻糖尿病性心肌损伤。2.探究利拉鲁肽对糖尿病性心肌自噬的作用及其潜在的分子作用机制。研究方法1.体内实验体内实验选用肥胖Zucker大鼠及其正常对照Zucker大鼠(8周龄)。肥胖Zucker大鼠给予高脂饮食,正常对照Zucker大鼠给予正常饮食。ZDF大鼠分组为:(1)正常对照组(Con组);(2)糖尿病性心肌病组(DCM组);(3)糖尿病性心肌病+利拉鲁肽组(DCM+LG组);(4)糖尿病性心肌病+氯喹组(DCM+CQ组);(5)糖尿病性心肌病加+利拉鲁肽+氯喹组(DCM+LG+CQ组)。皮下注射利拉鲁肽(200μg/kg),腹腔注射氯喹(25mg/kg),每天一次,连续注射8周。第16周,采集各组的大鼠血液样本用于进一步检测大鼠的血糖、血脂、心肌酶等生化指标。大鼠处死前一天,进行小动物超声心功能检测。将大鼠脱颈处死后,取材大鼠心肌组织进行固定,用于后续的电镜、免疫组织化学、Masson三色染色、蛋白免疫印迹技术(WB)检测。2.体外实验采用SD大鼠新生乳鼠(1-3天)原代心肌细胞。将原代心肌细胞培养于一定浓度的含葡萄糖培养液中,模拟体内高糖状态,建立原代心肌细胞高糖模型。细胞分组为:正常对照组(Con组)、高糖组(HG组)、高糖+利拉鲁肽组(HG+LG组)、高糖+氯喹(HG+CQ组)、高糖+利拉鲁肽+氯喹组(HG+LG+CQ组)、高糖+Comp C(HG+C)、高糖+利拉鲁肽+Comp C(HG+LG+C)。心肌细胞在高糖环境中培养96小时,利拉鲁肽和氯喹作用时间为24小时。每天更换细胞培养基。采用MTS检测心肌细胞活力;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡;采用Ad-mRFP-GFP-LC3病毒转染检测自噬流;采用WB检测自噬相关蛋白(LC3、p62)和AMPK信号通路相关蛋白(AMPK、mTOR)。研究结果1.利拉鲁肽减轻心肌细胞损伤(1)利拉鲁肽降低ZDF大鼠血脂血糖水平。血生化检测分析显示:与DCM组相比,利拉鲁肽处理组的血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)水平是下降的。(2)利拉鲁肽减轻ZDF大鼠心肌损伤。ZDF大鼠心脏超声检测结果显示:与DCM组相比,利拉鲁肽增加左室短轴缩短率(LVFS)值。血生化检测分析显示:在利拉鲁肽组,大鼠血清肌酸激酶(CK)和血清乳酸脱氢酶(LDH)水平下降。应用自噬抑制药物氯喹后,大鼠血清CK和LDH水平增高。(3)利拉鲁肽减轻高糖诱导的原代心肌细胞损伤。MTS检测结果显示:利拉鲁肽增加心肌细胞在高糖状态下的细胞活性。TUNEL检测显示:利拉鲁肽减少糖毒性引起的心肌细胞凋亡。在上述检测方法中,利拉鲁肽的保护作用可被自噬抑制药物氯喹大部分抑制。2.利拉鲁肽减轻ZDF大鼠心肌纤维化。Masson三色染色法显示:利拉鲁肽组心肌的胶原容积分数(CVF)小于DCM组。共同使用自噬抑制药物氯喹后,CVF值再次增大。3.利拉鲁肽增加心肌细胞内自噬水平。(1)在体内实验中,利拉鲁肽增加ZDF大鼠心肌组织的自噬表达水平。透射电镜检测显示:利拉鲁肽组的自噬小体的数量多于DCM组。免疫组织化学检测显示:利拉鲁肽组中LC3B蛋白的表达水平增加。WB检测显示:利拉鲁肽组中LC3Ⅱ/Ⅰ值增加,p62蛋白表达下降。在上述检测方法中,自噬抑制药物氯喹可部分消除利拉鲁肽对自噬的影响作用。(2)在体外实验中,利拉鲁肽增加高糖培养的原代心肌细胞内自噬水平。Ad-mRFP-GFP-LC3病毒转染检测显示:利拉鲁肽组的黄点(自噬体)和红点数量(自噬溶酶体)均增加,尤其是黄点(自噬体)增加明显。加入自噬体抑制剂3-MA后,黄点(自噬体)和红点(自噬溶酶体)均明显减少。WB检测显示:利拉鲁肽可增加LC3Ⅱ/Ⅰ值。与HG+CQ组相比,HG+LG+CQ组的LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加。4.利拉鲁肽激活原代心肌细胞内的AMPK-mTOR信号通路。WB检测显示:在利拉鲁肽组中,p-AMPK/AMPK比值增大(AMPK磷酸化水平增高)和p-mTOR/mTOR比值减小(mTOR磷酸化水平下降)。结论1.利拉鲁肽通过增加心肌细胞内的自噬水平减轻糖尿病性心肌损伤。2.AMPK信号通路参与介导利拉鲁肽促进糖尿病性心肌的自噬作用。