论文部分内容阅读
背景原发型肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全世界高发的恶性肿瘤之一,死亡人数在世界范围内居癌症相关死亡人数的第三位,在我国,肝癌的形势更加严峻,居癌症死亡人数的第二位,占全球的一半以上,每年约有11万人死于肝癌,目前临床上用于治疗肝癌的方法较多,主要包括手术切除、放射介入、放化疗、射频消融、肝移植等,其中手术切的疗效得到世界范围的公认,但大部分患者在确诊时即发生了远处转移,失去了手术机会。即使是根治性切除,5年内仍60%以上的患者出现复发转移,其他治疗方法的复发转移率更高。在肝癌的治疗领域仍未有突破。因此,针对性的抑制肝癌的侵袭转移,对提高肝癌患者的生存时间和改善患者的生存质量都具有重要意义。随着大规模基因测序的进行,人们发现仅仅不到2%基因组转录为蛋白编码RNA,然而,超过98%的基因转录为非蛋白编码RNA (noncoding RNA, ncRNA),根据非编码RNA所包含核苷酸的长度进行分类,长度超过200nt的非编码RNA称为长链非编码RNA (long non-coding RNA, IncRNA),但近年来的研究表明,长链非编码RNA具有强大的基因调控功能,发挥着关键作用,是基因调控不可缺失的环节。在前期研究中,发现了一条在肝癌组织中呈高度表达的基因UC001kfo. UCOOlkfo是新基因,pubmed数据库中未被收录,仅在UCSC和Ensembl中被诠释为非编码RNA,靶基因预测结果表明UC001kfo的靶基因为ACTA2,后者是α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin, a-SMA)的编码基因。UCOOlkfo和ACTA2的编码基因在染色体上有部分重叠区域,包含了ACTA2的启动子,UC001kfo与ACTA2有两段互补序列,预测UCOOlkfo的靶基因是a-SMA, UC001kfo通过调控a-SMA发挥作用。a-SMA在生物进化上高度保守,不同种属的α-肌动蛋白的序列非常接近,功能为参与细胞的运动、维持细胞形态,是构成细胞骨架、伪足的主要组成部分之一。a-SMA表达增高的肿瘤细胞具有间充质细胞的特征,研究表明,a-SMA与患者预后相关,是癌细胞侵袭力或上皮细胞间质化的标志。肿瘤的发生和转移是多步骤、多环节的过程。这在分子层面上表现为肿瘤的信号通路为网络状分布的,有多个节点,因此单一阻止其中一个环节并不能阻止肿瘤信号的传递,其他的节点可发生代偿并取代这部分功能,从而导致原有治疗方法的失效。a-SMA是肿瘤侵袭转移的物质基础,是肿瘤细胞的运动和转移侵袭的直接施行者。因此,以a-SMA为靶标的治疗可以避开肿瘤中间错综复杂的信号传递过程,从源头上避免肿瘤治疗效果差的现状。目的探讨新基因UC001kfo对人肝癌细胞株HepG2侵袭转移能力的影响及其对a-SMA的调控作用。方法l.siRNA的设计针对UC001kfo的序列,应用siRNA设计工具进行siRNA序列设计,通过BLAST分析剔除与其他基因有同源性的siRNA,经RNA结构分析软件分析,筛选出三条针对UCOOlkfo的siRNA,同时设计阴性对照和Fam标记的荧光对照各1条。2.转染人肝癌细胞株HepG2采用脂质体转染技术将UC001kfo-siRNA转染到HepG2细胞内,转染后24～48小时后进行相关实验及检测。3.指标的检测分别检测RNA干扰后UCOOlkfo与a-SMA的表达量,并作相关分析；细胞划痕试验检测(?)HepG2迁移能力变化,transwell小池试验检测HepG2侵袭能力的变化,平板克隆试验检测细胞群体依赖性和增殖能力,MTT法检测细胞增殖能力的改变。4.统计学处理采用SPSS v18.0统计软件分析,计量资料表示为均数±标准差(X±S),两组定量资料比较采用t检验,率的比较采用卡方检验,因素之间相关分析采用Spearman等级相关分析。结果1. siRNA干扰效率的检测分别应用3条siRNA转染HepG2,检测UC001kfo的表达量,筛选出干扰效率最强的siRNA,干扰效率为65%左右。2.细胞侵袭转移能力划痕试验结果显示,阴性对照组、RNA干扰组48h迁移距离分别为(17.23±0.28)μm和(10.45±0.53)μm,差异有统计学意义(P<0.05); transwell小池试验结果显示,RNA干扰组穿膜细胞数(56±10个)明显少于阴性对照组(141±14个)(P<0.05)。3.增殖能力检测克隆集落形成试验结果表明,RNA干扰组和阴性对照组的克隆形成率分别为(0.36±0.12)和(0.64±0.07),RNA干扰组的克隆形成率较阴性对照组显著降低(P<0.05)。MTT检测结果显示,RNA干扰组的细胞增殖抑制率较阴性对照组明显增高,UC001kfo被干扰12h后,HepG2的增殖能力明显降低(P<0.05)。4. RT-qPCR,及相关分析T-qRCR结果显示RNA干扰组UCO01kfo相对阴性对照组的表达量为0.35±0.22, a-SMA的表达为0.44±0.19,与阴性对照组比较两者表达差异有统计学意义(P<0.05),相关分析表明a-SMA与UCOOlkfo的表达量存在正相关(r=0.868,p=0.001)结论1.应用RNA干扰技术,将特异的siRNA片段转染入HepG2细胞内,可成功介导UC001kfo的沉默,从而达到UC001kfo基因敲除的效果。2. UCOOlkfo表达下调后,HepG2的运动能力及侵袭能力、克隆形成能力及增殖能力明显降低。3. UCOOlkfo与a-SMA具有良好的相关性,UCOOlkfo通过调控a-SMA而发挥基因调控的作用。