论文部分内容阅读
曲酸具有抗菌性、抗氧化性以及抑制酪氨酸酶活性,在酿造、化妆品和医药领域具有重要应用价值。天然曲酸是来源于曲霉属利用糖类发酵产生的次级代谢产物,米曲霉因其曲酸产量较高且不产生毒素被当成发酵曲酸最主要微生物。在以往研究中表明,压力响应因子msn2、曲酸合成基因簇中koj R以及全局调控转录因子laeA都与曲酸合成有一定影响。本实验以米曲霉3.042作为出发菌株,以pyrG营养缺陷作为筛选标记,构建msn2敲除质粒pk1,通过农杆菌AGL1介导转化获得米曲霉pyrG缺陷g-1菌株,在此基础上敲除msn2且回补pyrG基因,获得g-5菌株。与出发菌株米曲霉3.042相比,g-5菌株生长受到抑制且孢子生成量显著降低60%,在含10%及以上葡萄糖环境中不产孢,但可耐受30 mmol/L H2O2。g-5菌株摇瓶发酵曲酸产量达到21.55 g/L,较米曲霉3.042的11.86 g/L,提升了81%。经q RT-PCR分析,与米曲霉3.042相比,g-5菌株的msn2基因不表达;在发酵6d时米曲霉调节曲酸合成相关基因koj R和laeA基因表达量上调;g-5菌株菌丝生长及产孢相关基因brl A与tps1表达量大幅下调,相反age B基因表达量大幅上调。本实验构建过表达koj R质粒pk7,并转化米曲霉pyrG缺陷g-1菌株,筛选获得一株过表达koj R菌株同时回补pyrG缺陷的转化子58号。曲酸摇瓶发酵测得58菌株曲酸产量26.9 g/L,较3.042提升了127%。q RT-PCR结果显示,58号菌株koj R基因的相对表达量在3 d、6 d时大幅上调。相关曲酸基因簇koj A和koj T表达量也在3 d时明显增加,msn2和laeA相较于3.042也是有所提升。对58号菌株进行ARTP等离子诱变,将诱变后的菌株进行摇瓶发酵,获得一株的A-1菌株曲酸产量达到31 g/L,较58号的26.9 g/L,提升了15%。将laeA过表达质粒pk8转入农杆菌AGL1侵染米曲霉A-1号,最终获得一株尿苷/尿嘧啶营养缺陷型过表达laeA的转化子5号,摇瓶发酵结果29.42 g/L,较过表达koj R菌株58号26.9g/L提高9%,较3.042的11.86 g/L提高了148%。耐受H2O2和高糖能力明显降低,q RT-PCR结果显示laeA与koj R表达量显著高于出发菌株3.042,且两具有表达趋势一致,并且过表达laeA导致发酵发酵前期koj A增加表达量上调,在后期有助于koj T表达量的增加。同时探究了所有菌株中在HMP途径中GOD(葡萄糖脱氢酶)及Cat B(过氧化氢酶)基因的表达量,结果表明过表达koj R在6 d增幅最为明显,说明GOD在发酵后期仍然高表达,促进葡萄糖转化生成曲酸并且Cat B的表达而msn2抑制。而过表达laeA只在发酵前期对GOD对发挥促进转化作用,在整个发酵阶段对Cat B有微量的正向调控。通过单因素试验法确定A-1菌株曲酸发酵培养基的最优碳、氮源分别为麦芽糖和豆粕,在单因素实验的基础上进行正交优化培养基成分,优化后的培养基为:麦芽糖12%、豆粕0.4%、KH2PO40.1%、Mg SO40.15%、Na2Mo O40.05%。通过单因素实验法确定种子液发酵条件为:种龄33 h、接种量3.3×10~5个/m L。通过验证实验测得曲酸产量为38.2 g/L。