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嗜热真菌是一类最低生长温度为20℃或20℃以上,最高生长温度为50℃或50℃以上的特殊真菌类群。嗜热真菌在高温条件下具有独特的生存和适应能力,其产生的嗜热酶因在高温条件下的热稳定性和高活力,是一种很好的新型催化剂,具有较大商业价值。可广泛应用于酿造、发酵、食品、日用化工、纺织、制革、医药、废水处理等领域,也是研究生物进化和热稳定酶的重要微生物来源。
本研究在前期充分调查云南腾冲地区的高温热泉的嗜热真菌资源,并对其进行分离培养的基础上,对嗜热真菌产生的木聚糖酶和内切β-葡聚糖酶活性进行筛选,并从嗜热毁丝霉Myceliophthorasp.T23菌株中得到活性好、热稳定性高的内切β-葡聚糖酶,对其进行分离纯化、酶学性质研究以及基因的克隆,主要取得以下研究结果:
1.嗜热真菌产生的木聚糖酶和内切β-葡聚糖酶活性筛选:通过发酵提取粗酶液,DNS检测还原糖的方法,从63株嗜热真菌中筛选出了21株木聚糖酶活性较高菌株和13株内切β-葡聚糖酶的高活性菌株。其中,菌株3-1具有很高的木聚糖酶热稳定性,菌株2-3均有较高的内切β-葡聚糖酶热稳定性。
2.嗜热毁丝霉内切β-葡聚糖酶的分离纯化和酶学性质研究:通过硫酸铵分级沉淀,疏水交换层析和两步阴离子交换层析得到了电泳谱带较均一的内切β-葡聚糖酶。其分子量约为45kDa,最适反应温度和pH值分别为55℃和4.0。该酶具有很高的热稳定性和耐碱性,70℃保温60min后仍然保留60%左右的酶活,pH11.0的缓冲液中保存30min后,剩余50%左右的酶活。Mn2+对该酶有明显的激活作用,而Fe3+、A13+、Cu2+、Ag+对酶有显著的抑制作用。在最适反应条件下,内切β-葡聚糖酶的Km为8.9262mg/ml。
3.嗜热毁丝霉内切β-葡聚糖酶基因的克隆:对内切β-葡聚糖酶的N-末端氨基酸进行了测序,序列为:D-F-Q-P-V-L-H-L-V-A。在NCBI数据库中进行相似性搜索,没有找到相应的内切β-葡聚糖酶序列。
对ITS序列所构建的进化树分析后,在NCBI数据库中找到了具有内切β-葡聚糖酶基因报道、且和Myceliophthorasp.T23亲缘关系最近的毛壳菌ChaetomiumglobosumCBS148.51。再根据ChaetomiumglobosumCBS148.51的两个内切β-葡聚糖酶基因序列以及其它真菌来源的内切β-葡聚糖酶基因序列设计简并引物,克隆得到了475bp的内切β-葡聚糖酶基因片段,编码157个氨基酸的部分内切β-葡聚糖酶基因。
本论文的创新性主要体现为:
1.从Myceliophthorasp.T23中分离纯化出一个内切β-葡聚糖酶,并对其酶学性质进行了研究,对N-末端氨基酸进行了测序,该酶可能是纤维素酶超家族中的一个新成员。
2.设计简并引物,首次通过PCR扩增得到了嗜热毁丝霉属内切β-葡聚糖酶基因的部分片段。