DDT (Dichlorodiphenyltrichloroethane)是一种在环境中广泛存在的内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals, EDCs),是第一个被广泛使用的人工合成有机氯农药(organochlorine pesticides, OCPs)。1939年发现DDT具有杀虫剂作用,因此在二战期间被广泛运用于疟疾和斑疹伤寒等传染病的控制。同时,DDT是一种持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs),它具有生物蓄积性、长距离迁移性、环境持久性和抗雄激素作用等特性,可能对生物和环境造成长期的危害,近年来引起了人们的广泛关注。虽然已经被禁用了三十多年,但是在一些发展中国家,DDT在公共卫生领域仍然被大量使用。p,p’-DDE (1,1-dichloro-2,2 bis (p-chlorophenyl) ethylene)是DDT在环境和机体内最持久、浓度最高的代谢产物。它是一种内分泌干扰物,广泛存在于环境中。研究表明,一些大鼠和野生动物的性发育异常可能与p,p’-DDE暴露有关。p,p’-DDE具有抗雄激素作用,可以拮抗雄激素与雄激素受体结合。细胞凋亡(apoptosis)是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起的细胞主动死亡的过程,这一过程对于消除机体内老化细胞或具有潜在性异常生长的细胞以保持机体处于稳定状态起着重要作用。在睾丸中,75%的生精细胞死于白发性凋亡以维持成熟精子的质量和数量。然而,过度的或者过少的睾丸细胞凋亡也会导致精子发生的异常和生殖系统的肿瘤。在啮齿类动物中,热、辐射及一些外源性的化学物质都可以诱导生精细胞凋亡。尽管DDT和它的代谢产物p,p’-DDE可以诱导组织或细胞发生凋亡,但是关于p,p’-DDE对男性生殖系统作用的报道较少。本研究的目的就是从细胞培养和动物实验(包括青春前期和青春期大鼠)两个方面探讨p,p’-DDE对大鼠睾丸细胞的Fas/FasL和内质网通路的影响,并观察p,p’-DDE对睾丸细胞凋亡的影响,进而揭示Fas/FasL和内质网通路与睾丸细胞凋亡之间的关系。第一部分p,p’-DDE对大鼠睾丸支持细胞凋亡的影响及其机制研究一、p,p’-DDE对支持细胞凋亡的影响目的：探讨p,p’-DDE对支持细胞凋亡的影响。方法：对离体培养的大鼠支持细胞分别用不同终浓度的10、30、50μmol/Lp,p’-DDE染毒24h,以及300μmol/L NAC预处理1h后再染毒50μmol/L p,p’-DDE,用流式细胞仪PI-Annexin v双染法测定细胞凋亡。结果：30、50μmol/L的p,p’-DDE可诱导支持细胞凋亡,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。而且抗氧化剂NAC可以明显拮抗p,p’-DDE引起的细胞凋亡(P<0.05)。结论：p,p’-DDE可以剂量—依赖性的诱导支持细胞凋亡,NAC预处理可以阻断p,p’-DDE诱导的支持细胞凋亡二、p,p’-DDE对支持细胞FasL、caspase-3及-8 mRNA和蛋白表达水平的影响目的：探讨p,p’-DDE对支持细胞FasL通路相关基因FasL、caspase-3及-8表达的影响。方法：采用RT-PCR测定支持细胞中FasL、caspase-3及-8 mRNA的表达水平。采用Western blotting测定支持细胞中FasL、caspase-3及-8蛋白表达水平。结果：大鼠睾丸支持细胞FasL mRNA表达水平在50μmol/L剂量组显著增高；caspase-3 mRNA表达水平在30、50μmol/L剂量组明显高于对照组；caspase-8 mRNA表达水平随p,p’-DDE剂量的增加而增加,10、30、50μmol/L剂量组与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。大鼠睾丸支持细胞FasL蛋白表达水平随p,p’-DDE剂量的增加而增加,10、30、50μmol/L剂量组与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05),并且NAC可以拮抗p,p’-DDE诱导的FasL蛋白水平的改变；不同浓度的p,p’-DDE作用于支持细胞细胞24h后,caspase-3、-8酶原裂解增加,表明caspase-3、-8被激活。结论：p,p’-DDE可通过诱导支持细胞FasL mRNA和蛋白水平增加,激活caspase-3、-8;通过氧化应激激活FasL凋亡通路。三、p,p’-DDE对支持细胞calpain-1及caspase-12 mRNA表达水平的影响目的：探讨p,p’-DDE对支持细胞内质网通路相关基因calpain-1及caspase-12表达的影响。方法：采用Real time-PCR测定支持细胞中calpain-1及caspase-12 mRNA的表达水平。结果：各个p,p’-DDE染毒组与对照组比较,calpain-1及caspase-12 mRNA表达水平改变不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：p,p’-DDE对支持细胞calpain-1及caspase-12 mRNA表达水平影响不明显,内质网通路是否在支持细胞凋亡中发挥作用有待进一步研究。第二部分p,p’-DDE对青春前期SD大鼠睾丸细胞凋亡的影响及其机制研究一、p,p’-DDE对青春前期大鼠脏器系数和睾丸组织病理结构的影响目的：探讨p,p’-DDE染毒对青春前期大鼠脏器系数和睾丸组织超微病理结构的影响。方法：用不同浓度的p,p’-DDE(0、20、60、100mg/kg)隔天对青春前期大鼠染毒10天后,处死动物,称重脏器,电镜观察大鼠睾丸组织超微病理结构的改变。结果：与对照组比较,高剂量p,p’-DDE染毒组大鼠肝脏系数较高,差异有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠睾丸的脏器系数间比较,差异均无统计学意义。电镜结果显示p,p’-DDE染毒可使支持细胞、精原细胞、初级精母细胞、精子细胞及间质细胞出现空泡、线粒体肿胀和核浓缩。结论：p,p’-DDE染毒对青春前期大鼠睾丸重量及脏器系数影响不明显,但可引起睾丸组织内各种细胞超微病理结构的变化,包括空泡化、线粒体肿胀和核浓缩。二、p,p’-DDE对青春前期大鼠睾丸组织氧化应激及凋亡的影响目的：探讨p,p’-DDE对青春前期SD大鼠睾丸组织氧化应激及凋亡的影响。方法：用比色法测定睾丸组织总SOD活力、MDA含量和GSH-PX活性,TUNEL法检测大鼠睾丸细胞凋亡。结果：与对照组比较,高、中、低剂量p,p’-DDE染毒组SOD活力降低,中、高剂量p,p’-DDE染毒组MDA含量升高,高剂量p,p’-DDE染毒组GSH-PX活力下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。20、60、100mg/kgp,p’-DDE均可诱导睾丸细胞凋亡,以精原细胞和精母细胞为主,伴有支持细胞凋亡结论：p,p’-DDE染毒可引起青春前期大鼠睾丸组织氧化应激和细胞凋亡增加。三、p,p’-DDE对青春前期大鼠睾丸组织Fas、FesL、caspase-3、-8及NF-κB的影响目的：探讨Fas/FasL通路和NF-κB在p,p’-DDE诱导青春前期大鼠睾丸组织凋亡中的作用。方法：采用Real time-PCR测定大鼠睾丸组织中Fas、FasL、caspase-3、-8 mRNA的表达水平。采用Western blotting测定睾丸组织中Fas、FasL、caspase-8及核蛋白NF-κB的蛋白表达水平。用试剂盒测定caspase-3、-8的活性。结果：青春前期大鼠睾丸组织Fas、FasL、caspase-3及-8 mRNA表达水平在100mg/kgp,p’-DDE高剂量组显著增高,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。青春前期大鼠睾丸组织Fas蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量组FasL蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)；100mg/kgp,p’-DDE染毒青春前期大鼠10天后,睾丸组织caspase-8酶原裂解增加,表明caspase-8被激活。中、高剂量组核内NF-κB p65蛋白表达水平较对照组比较显著升高,说明NF-κB p65转位到细胞核被激活。与对照组比较,低剂量组、中剂量组caspase活性变化不明显,但高剂量组的caspase-3、-8活性较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：p,p’-DDE染毒可诱导青春前期大鼠睾丸组织Fas、FasL表达增加,激活caspase-3、-8,引起NF-κB核转位,从而激活Fas/FasL凋亡通路。四、p,p’-DDE对青春前期大鼠睾丸组织calpain-1及caspase-12 mRNA和蛋白表达水平的影响目的：探讨内质网通路在p,p’-DDE诱导青春前期大鼠睾丸组织凋亡中的作用。方法：采用Real time-PCR测定大鼠睾丸组织calpain-1及caspase-12 mRNA的表达水平。采用Western blotting测定睾丸组织中calpain-1及caspase-12的蛋白表达水平。结果：青春前期大鼠睾丸组织calpain-1及caspase-12 mRNA表达水平在高剂量组显著增高,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。青春前期大鼠睾丸组织calpain-1蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量组caspase-12蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),表明caspase-12被激活。结论：p,p’-DDE通过激活caspase-12而诱发内质网凋亡通路导致细胞凋亡。第三部分p,p’-DDE对青春期SD大鼠睾丸细胞凋亡的影响及其机制研究一、p,p’-DDE对青春期大鼠脏器系数的影响目的：探讨p,p’-DDE染毒对青春期大鼠脏器系数的影响。方法：用不同浓度的p,p’-DDE(0、20、60、100mg/kg)隔天对青春期大鼠染毒10天后,处死动物,称重脏器,计算脏器系数。结果：各组大鼠睾丸的脏器系数间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论：p,p’-DDE染毒对青春期大鼠睾丸重量及脏器系数影响不明显。二、p,p’-DDE对青春期大鼠血清氧化应激及睾丸组织凋亡的影响目的：探讨p,p’-DDE对青春期大鼠血清氧化应激及睾丸组织凋亡的影响。方法：用比色法测定血清总SOD活力、MDA含量和GSH-PX活性,TUNEL法检测大鼠睾丸细胞凋亡。结果：与对照组比较,中剂量p,p’-DDE染毒组SOD、GSH-PX活力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各个剂量p,p’-DDE染毒组MDA含量变化不明显(P>0.05)。20、60、100mg/kg p,p’-DDE均可诱导睾丸细胞凋亡,以精原细胞和精母细胞为主,伴有支持细胞凋亡。结论：p,p’-DDE染毒可引起青春期大鼠血清氧化应激和睾丸组织细胞凋亡增加。三、p,p’-DDE对青春期大鼠睾丸组织Fas、FasL、caspase-3及-8 mRNA表达水平的影响目的：探讨Fas/FasL通路在p,p’-DDE诱导青春期大鼠睾丸组织凋亡中的作用。方法:采用Real time-PCR测定大鼠睾丸组织中Fas、FasL、caspase-3、-8mRNA的表达水平。结果：青春期大鼠睾丸组织中FasL.caspase-3 mRNA表达水平在60mg/kgp,p’-DDE中剂量组显著增高,中、高p,p’-DDE剂量组Fas mRNA及低、中、高p,p’-DDE剂量组caspase-8 mRNA表达水平与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：p,p’-DDE染毒可诱导青春期大鼠睾丸组织Fas.FasL表达增加,激活caspase-3、-8,从而激活Fas/FasL凋亡通路。四、p,p’-DDE对青春期大鼠睾丸组织calpain-1及caspase-12 mRNA表达水平的影响目的：探讨内质网通路在p,p’-DDE诱导青春期大鼠睾丸组织凋亡中的作用。方法：采用Real time-PCR测定大鼠睾丸组织calpain-1及caspase-12 mRNA的表达水平。结果：青春期大鼠睾丸组织中caspase-12 mRNA表达水平在60mg/kgp,p’-DDE中剂量组显著增高,中、高p,p’-DDE剂量组calpain-1 mRNA表达水平与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：p,p’-DDE可能通过内质网通路导致青春期大鼠睾丸细胞凋亡。五、p,p’-DDE对青春期大鼠精子活力的影响目的：探讨p,p’-DDE对青春期大鼠精子活力的影响。方法：采用CASA检测青春期大鼠精子活力参数。结果：与对照组比较,低剂量组活动精子密度明显减少,中剂量组活动精子密度、曲线运动速率、精子头侧摆幅度、鞭打频率有显著性下降(P<0.05)。而高剂量组各个指标变化不明显(P>0.05)。结论：p,p’-DDE染毒可使青春期大鼠精子活力下降。