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背景多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性最常见的生殖内分泌及代谢功能障碍性疾病,主要影响生殖及代谢功能,表现为高雄激素血症、稀发排卵或无排卵及卵巢多囊样改变。该综合征病因复杂,与遗传基因相关,其与亚临床心血管疾病、胰岛素抵抗(IR)、子宫内膜癌及卵巢癌的患病率成正相关,其中颗粒细胞的IR及凋亡在PCOS的发生发展中有着非常重要的作用;并且发病机制与环境因素密切相关,最近研究提示表观遗传调控机制参与了多囊卵巢综合征发病过程。MicroRNA(miRNA)是一种短链非编码RNA,在转录后水平抑制下游靶基因表达,参与基因的表达调控,并且在很多生物学过程中发挥关键作用,例如细胞的生长、分化、代谢、凋亡、激素合成及血管再生。目前已有研究证实,在PCOS患者中,许多miRNAs(miR-22、miR-132、miR-141、miR-21等)在卵巢组织中差异表达,异常表达的miRNA谱可能与PCOS的病理生理学过程相关。SIRT1基因是组蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族成员,在调控细胞增殖/凋亡、免疫反应、胰岛素分泌及糖代谢方面具有重要作用。为了提高临床个体化精准治疗水平,miRNA及相关靶基因对发病机制的调控成为研究热点。目的前期研究中我们已经得出,在PCOS患者的颗粒细胞中miR-9-5p表达上调,此次我们期望通过研究miR-9-5p和靶基因SIRT1,找到PCOS人群中调控颗粒细胞胰岛素抵抗及凋亡的新靶点。并且通过增加或者敲低miR-9-5p的表达从而验证miR-9-5p通过SIRT1介导颗粒细胞的胰岛素抵抗及凋亡,为将来药物治疗PCOS提供理论依据。方法1、收集38例人卵泡液并从中提取颗粒细胞,其中包括25例PCOS患者(胰岛素抵抗组13例和非胰岛素抵抗组12例)和13例年龄与之匹配的对照组,组间进行临床资料回顾性分析。2、对GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中公开发布的四个高通量芯片数据GSE34526,GSE98595,GSE10946,GSE102293进行整合分析,筛选差异表达基因,分别分析四个高通量芯片中SIRT1在PCOS与对照组中的表达量,继续进行GO和KEGG分析。3、应用实时定量PCR技术验证胰岛素抵抗组、非胰岛素抵抗组和对照组三组颗粒细胞中miR-9-5p的差异表达,免疫印迹验证三组颗粒细胞中SIRT1的差异表达。4、采用多个miRNA的靶基因预测软件筛选得出SIRT1是miR-9-5p的多个靶基因之一。5、应用免疫印迹、免疫荧光实验检测miR-9-5p/SIRT1对颗粒细胞胰岛素抵抗的影响,并观察在诱导胰岛素抵抗的过程中,AKT、PI3K磷酸化水平的变化。6、应用MTT实验和Tunel荧光染色检测miR-9-5p/SIRT1对颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果1、根据HOMA-IR指数将PCOS患者分为胰岛素抵抗组(PCOS-IR组,HOMA-IR≥2.57)和非胰岛素抵抗组(PCOS-NIR组,HOMA-IR<2.57),PCOS组与对照组相比,BMI、T、LH/FSH、FPG、FINS和HOMA-IR数值均升高且差异具有统计学意义(P<0.05);PCOS-IR组与PCOS-NIR组相比,BMI、T、FPG和INS数值升高且差异具有统计学意义(P<0.05)。2、四个高通量芯片数据整合分析后,样本量包括26例PCOS颗粒细胞样本与16例非PCOS的对照组颗粒细胞样本,筛选出970个差异表达的基因,且四个基因表达谱数据中SIRT1基因在PCOS组均表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。KEGG通路富集中筛选得出高表达的PI3K/AKT细胞通路,进行下一步的实验验证。3、PCOS-IR组中miR-9-5p的表达均高于PCOS-NIR组和对照组(P<0.05);PCOS-IR组中SIRT1的表达均低于PCOS-NIR组和对照组(P<0.05)。4、miR-9-5p与SIRT1 mRNA的3’-UTR之间存在互补配对,生物信息学分析提示SIRT1为miR-9-5p的靶基因。5、成功转染细胞后,发现miR-9-5p在转录后水平下调SIRT1的表达,miR-9-5p/SIRT1可以通过抑制PI3K/AKT细胞通路,减少颗粒细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT4)分子的表达进而诱导胰岛素抵抗的发生。6、miRNA 9-5p/SIRT1可以促进颗粒细胞凋亡。结论1、本研究提示miRNA 9-5p靶向下调SIRT1的表达后,抑制PI3K/AKT的磷酸化水平,诱导颗粒细胞胰岛素抵抗的发生。2、研究证实PCOS-IR组中上调的miRNA 9-5p可通过抑制SIRT1的表达促进颗粒细胞凋亡,进而促进卵泡闭锁,导致成熟障碍。