研究背景核苷酸还原酶(RR)可催化二磷酸核苷(NDPs)转变成脱氧二磷酸核苷(dNDPs),进一步提供三磷酸脱氧核苷(dNTPs),是DNA合成和复制过程中必不可少的限速酶。RR全酶结构包括大亚基α和小亚基β,形成α2β2的异四聚体结构后方具备活性。在人体中,一个大亚基RRM1和2个小亚基(RRM2和p53R2)已经鉴定出来。大亚基RRM1包括底物和变构效应物位点,调控RR全酶的活性及参与底物的还原。新近克隆出的p53R2基因是RR家族的新成员,与RRM2有80%的同源性。在紫外线、γ射线或是阿霉素刺激后,在p53诱导下,细胞内p53R2表达上升,与RRM1形成RR全酶,提供dNTPs,直接参与DNA的修复。研究发现：敲除p53R2基因的小鼠在8周时于肾脏内发现大量的凋亡细胞,在14周时死于严重的肾衰竭。其他一项对儿童线粒体耗竭综合症患者的研究发现：p52R2的突变与肌肉中线粒体DNA的含量耗竭直接相关。以上研究提示：当细胞处于休眠期时,以p53R2/RRM1为核心的核苷酸还原酶在线粒体DNA的合成过程中起重要的作用。虽然在非增生期的细胞中可通过线粒体内脱氧鸟苷激酶和胸苷激酶的补救合成途径来合成dNTPs,两种酶中任何一种突变都会造成线粒体DNA的耗竭并引起严重的疾病。但此时仅仅通过补救合成途径来提供dNTPs是远远不够的,同样需要p53R2催化的核苷酸还原作用。迄今为止,对p53R2如何影响线粒体DNA的合成,p53R2是否聚集于线粒体内以及p53R2是否影响线粒体的功能依旧知之甚少。在溃疡性结肠炎的研究中发现：破坏p53-p53R2介导的DNA修复系统会导致结肠肿瘤的发生。p53R2表达受抑制后,经紫外线的刺激,发现TK6细胞内的突变率上升了3倍。而我们先前在大肠癌中的研究表明：p53R2表达水平和肿瘤的浸润及转移呈负相关。在另一方面,抑制p53R2表达可增加KB, PC-3, HSC-3及Ca9-22肿瘤细胞的侵袭能力。因此,p53R2在恶性肿瘤中的作用可能与RRM2相反,对肿瘤的增生及转移有潜在的抑制作用。但迄今为止,p53R2表达水平与大肠癌的预后是否相关仍不清楚。研究目的明确p53R2是否影响KB及PC3细胞中线粒体DNA的拷贝数及线粒体的dNTP库；研究p53R2是否聚集于KB及PC3细胞线粒体中；探索KB及PC3细胞线粒体中是否有RR活性;研究p53R2是否影响KB及PC3细胞中线粒体的功能；判断p53R2是否可影响大肠癌的预后。研究内容第一部分p53R2聚集于KB及PC3细胞线粒体中并影响线粒体功能第一章在KB和PC3细胞系中,p53R2表达水平与线粒体DNA拷贝数及线粒体数量呈正相关前述研究发现在人类及小鼠中,p53R2突变均可引起严重的线粒体DNA耗竭。为在肿瘤细胞系中进一步证实此结论,我们用p53R2 siRNA抑制p53R2的表达,48小时后用定量PCR的方法扩增线粒体基因COX-1并检测线粒体DNA拷贝数的变化。结果发现：抑制p53R2后,KB及PC3细胞内线粒体DNA拷贝数分别下降为41.7%和34.9%(p<0.05)。而用另一个线粒体基因NDl检测也得到类似的结果,KB及PC3细胞内线粒体DNA拷贝数分别下降为30.1%和27.4%(p<0.05)。为探索p53R2表达抑制后细胞内线粒体数量的变化,我们用免疫电镜观察其变化。我们发现：p53R2表达抑制后细胞内线粒体数量明显下降(p<0.05)。以上结果说明在KB与PC3细胞系中,p53R2表达水平与线粒体DNA拷贝数及线粒体数量呈正相关。第二章p53R2聚集于KB及PC3细胞的线粒体中,通过线粒体外膜转位酶复合体转运入线粒体内我们分离细胞浆和线粒体后,用Western blot的方法检测p53R2在蛋白水平的表达,结果发现在线粒体成分中含有p53R2。为进一步证实此结果,我们用细胞色素C及p53R2抗体分别标记线粒体及p53R2,通过免疫荧光的方法观察p53R2的定位,发现p53R2聚集于KB及PC3细胞的线粒体中。我们还用绿色荧光蛋白和线粒体示踪剂分别标记p53R2和线粒体,通过共聚焦显微镜观察p53R2与线粒体的定位,同样证实了前面的结果。定量分析结果显示：p53R2与KB及PC3细胞中线粒体的重叠率分别为66.8%及61.2%。最后我们用免疫金标记p53R2后通过免疫电镜观察细胞的亚显微结构,发现KB及PC3细胞线粒体内有p53R2颗粒的聚集。为探索p53R2是否动态存在于线粒体内,我们用无血清培养法同步细胞周期,随后加入含10%血清的培养基后每隔2小时观察细胞内p53R2的动态变化,发现线粒体内的p53R2未发生明显变化。说明p53R2聚集于KB及PC3细胞线粒体内,但与细胞周期无直接关系。以上4种不同的实验方法均证实p53R2聚集于KB及PC3细胞线粒体内,并于细胞周期无关。几乎所有的线粒体前体蛋白都是通过线粒体外膜转运酶复合体(TOMcomplex)转运入线粒体内。Tom40是TOM复合体的核心成分,是一个具有桶状结构的膜内在蛋白质,可形成前体蛋白穿越的通道。我们用Tom40 siRNA抑制Tom40的表达水平后进一步检测KB及PC3细胞线粒体内p53R2的含量是否受影响。结果发现：抑制Tom40的表达后,线粒体内p53R2含量也随之降低,而细胞浆内的p53R2水平没有明显变化。此结果说明p53R2通过TOM复合体转运入线粒体内。第三章线粒体内不存在RR的活性,降低p53R2表达并未引起线粒体dNTP库的显著降低为进一步探索线粒体中p53R2的作用,我们分别检测了细胞浆和线粒体成分中RR的活性。和细胞浆中RR的活性相比,线粒体中几乎测不到RR的活性。KB及PC3细胞线粒体中RR的活性只有细胞浆中活性的4.96%及0.96%。由于RRM2或p53R2必需与RRM1形成具有四聚体结构的RR全酶才具备核苷酸还原的活性。为了证实线粒体中不具备RR活性的原因,我们用Western blot的方法检测RRM1是否在线粒体内存在,结果发现线粒体中不存在RRM1,这进一步证实了线粒体中不具备RR活性。为研究p53R2对KB及PC3细胞内线粒体dNTP库的影响,我们用p53R2siRNA抑制p53R2的表达,随后检测其变化。我们发现：抑制p53R2表达后,KB细胞线粒体dATP、dTTP、dCTP、dGTP及总dNTP库从7.3、12.6、21.8、11.9和53.6分别下降到5.8、11.4、20.5、7.9和45.6 pmoles／百万细胞。而PC3细胞线粒体dATP、dTTP、dCTP、dGTP及总dNTP库从4.0、2.6、1.9、1.7及10.2分别下降至2.7、2.2、1.4、1.5及7.8 pmoles／百万细胞。但均未见统计学意义。此研究说明：在正常状态下的KB及PC3中,p53R2对细胞线粒体dNTP库影响不大。此部分研究主要说明线粒体内不存在RRM1,不具备RR的活性,提示线粒体内的p53R2可能具有其他的功能。第四章p53R2影响KB及PC3细胞线粒体功能：包括线粒体膜电位,ATP合成及细胞色素C氧化酶活性等我们用JC-1来检测p53R2表达与线粒体膜电位的关系。结果发现：抑制p53R2后,代表受损线粒体的R1比例明显上升。在KB及PC3细胞中,R1比例分别从15.1%及16.1%上升至32.4%及27.1%。此研究说明p53R2的抑制可引起线粒体膜电位的破坏。同时,我们还检测了细胞内游离ATP的浓度和线粒体内细胞色素C氧化酶活性的变化。我们发现：p53R2表达降低后,KB及PC3细胞内游离ATP浓度分别减少59.3%和62.82%p<0.05)。而细胞色素C氧化酶的活性则分别下降了88.8%和87.3%p<0.05)。说明p53R2可影响ATP的合成及细胞色素C氧化酶的活性。第二部分p53R表达水平与大肠癌预后呈负相关我们收集了浙江大学医学院附属二院1999-2004年间接受过大肠癌外科治疗的220例病例资料。同时收集了美国City of Hope国家医学中心107例大肠癌病例资料作为验证。所以患者均接受定期随访。我们用免疫组化染色分析p53R2的表达情况。对浙江大学附属二院220例样本的单因素及多因素分析结果显示：p53R2与肿瘤浸润程度呈负相关(校正OR=0.5,95%区间0.2-1.0)。生存分析结果发现：p53R2表达水平与大肠癌患者的预后密切相关(校正HR=0.56,95%区间0.32-0.98),p53R2高表达提示良好的预后。进一步分析显示：在Ⅲ-Ⅳ期大肠癌中,p53高表达与良性预后相关(校正HR=0.53,95%区间0.28-1.01),而在Ⅰ-Ⅱ期大肠癌中,p53表达水平与预后相关性不大(校正HR=1.02,95%区间0.31-4.58)。对City of Hope的Ⅳ期大肠癌样本分析同样证明此结论(校正HR=0.42,95%区间0.20-0.91)。同时,我们还发现p53阳性的病例中,p53R2表达与大肠癌预后呈负相关(HR=0.2995%区间0.14-0.63)；而p53阴性的病例中,p53R2表达与大肠癌预后无明显相关性(校正HR=0.9995%区间0.42-2.43)。研究结论1.在KB与PC3细胞系中,p53R2表达水平与线粒体DNA拷贝数及线粒体数量呈正相关。2.p53R2聚集于KB及PC3细胞的线粒体中,通过线粒体外膜转位酶复合体转运入线粒体内。3.在KB及PC3细胞线粒体内不存在RR的活性,抑制p53R2表达水平并未明显降低线粒体dNTP库。4.在KB与PC3细胞系中,p53R2的表达降低可抑制线粒体的功能：包括线粒体膜电位受损、ATP合成下降及细胞色素C氧化酶活性的降低。5.p53R表达水平与大肠癌的预后呈负相关,p53R2高表达提示良性预后。