二十世纪九十年代以来，随着细胞生物学、分子生物学、免疫学以及遗传学等基础学科的迅猛发展以及干细胞和组织工程技术在现代医学基础研究和临床中的应用，再生医学已初步显示出良好的发展前景，使得牙齿再生逐步成为可能，这引起了越来越多的学者对这一领域的关注。目前牙再生研究中的热点主要集中在牙发育的分子网络调控上。细胞信号转导是胞膜窖／窖蛋白(caveolae／caveolin-1)最重要的生理功能之一。caveolae是细胞信号转导的平台，使各信号通路的串话成为可能，caveolin-1处于该平台中各个信号通路的中心位置。发育生物学研究证实，在颅神经嵴细胞分化形成牙颌骨器官的过程中，先后经历了颅神经嵴到第一鳃弓外胚间充质再到牙颌骨外胚间充质两次关键性级联分化。本课题旨在建立小鼠第一鳃弓外胚间充质细胞及下颌第一磨牙牙胚间充质细胞体外培养模型，在此基础上，进行诱导分化研究，鉴定其细胞生物学特性。同时，采用分子生物学等技术手段，为揭示caveolae／caveolin-1在牙发育过程中的分子调控机制提供理论依据。本研究共分以下几个部分：一．外胚间充质细胞和牙胚间充质细胞体外培养模型的建立。解剖分离E9.5小鼠第一鳃弓及E16.5小鼠下颌第一磨牙牙胚，采用改良酶消化法对其进行原代培养，利用反复贴壁和多次差异消化法对其进行纯化，通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细胞倍增时间和特异性标记物检测对其细胞生物学特性进行研究。在此基础上，取第5代细胞，更换不同的条件培养液，观察其在矿化诱导液的刺激下，细胞形态学变化，并检测鉴定相应的特异性细胞表型标记，对细胞的可塑性进行研究。二．小鼠牙发育过程中caveolae／caveolin-1表达的初步研究。在间充质细胞体外培养模型建立的基础上，采用透射电子显微镜和流式细胞仪的方法观察外胚间充质细胞和牙胚间充质细胞的生长周期中caveolae的超微形态变化，通过免疫组化和RT-PCR观察caveolin-1在外胚间充质细胞牙向分化过程中的表达情况，了解两者之间可能存在的相互关系。三．构建小鼠caveolin-1基因重组腺病毒载体。应用AdEasy重组腺病毒载体系统，以细菌内质粒间同源重组的方法构建携带小鼠caveolin-1编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-caveolin-1，并在293细胞中扩增制备该重组腺病毒。可用于caveolin-1基因功能的研究，亦可应用于在牙组织工程中对种子细胞进行基因修饰和改造，模拟caveolin-1在体内牙胚发育过程中的时空特异性表达。四．caveolin-1过表达促进cyclinD1介导的细胞增殖。通过pAd-caveolin-1转染外胚间充质细胞及牙胚间充质细胞，用流式细胞仪检测转染后细胞周期蛋白的改变，RT-PCR检测细胞周期蛋白cyclin D1基因的表达，以明确caveolin-1是否参与了cyclinD1细胞增殖的调控作用。研究结果表明E9.5胎鼠第一鳃弓界限清楚明确，便于准确取材，采用改良酶消化法原代培养细胞时间约2～3天，上皮细胞成分较少，可以在短时间内获得数量充足、纯度较高的满足实验要求的细胞。特异性标记物CD57免疫细胞化学染色呈均一表达。对外胚间充质细胞及牙胚间充质细胞的流式细胞仪检测、电镜观察、免疫细胞染色及RT-PCR检测显示，这两种细胞在增殖、caveolae的形态及基因的表达等方面均有差异，这提示caveolae和caveolin-1可能与细胞的增殖和成熟有关，通过小鼠caveolin-1基因重组腺病毒载体过表达caveolin-1，显示转染前外胚间充质细胞中cyclin D1的表达高于牙胚间充质细胞cyclin D1的表达。转染后两种细胞中cyclin D1的表达都有明显的下降，表明caveolin-1参与了cyclin D1介导的细胞增殖信号通路的调控。综上所述，本研究建立了E9.5外胚间充质细胞和E16.5牙胚间充质细胞体外培养模型，所培养外胚间充质细胞及牙胚间充质细胞具有高度的增殖活性和自我更新能力，具有多向分化潜能。通过构建小鼠的caveolin-1腺病毒表达载体，转染外胚间充质细胞和牙胚间充质细胞，采用RT-PCR、透射电镜、免疫组织化学等研究方法，初步研究了caveolae／caveoliln-1在小鼠牙发育过程中作用，结果表明caveolin-1参与了cyclin D1介导的细胞增殖信号通路的调控，为进一步研究奠定了基础。