背景:DNA损伤可能来自机体的内在因素的作用,例如活性氧、细胞新陈代谢的副产物以及DNA在复制过程中由于拓扑异构酶失活而导致的错配;也可能来自电离辐射(IR)、紫外光照射(UV)以及自然界中其它致癌物等外在因素的影响。DNA损伤会导致基因突变和细胞衰老。细胞发生DNA损伤并对其进行精确、高效修复的机制被称为DNA损伤应答机制(DDR),其作用是保护机体免受DNA损伤造成的不利影响。增殖细胞核抗原PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在DNA损伤修复机制中起着核心作用。PCNA作为一个稳定的“站台”,在损伤修复过程中招募一系列与复制相关的蛋白。类泛素蛋白(ubiquitin-like proteins,UBLs),是一类与泛素类似的小蛋白家族。据报道,类泛素蛋白含有与泛素同源的结构域,其同源性大约为15%-16%。UBLs可以分为两个亚家族:类泛素结构域家族UDP和类泛素家族修饰蛋白家族ΜLM。UDP可以与泛素以及泛素修饰蛋白发生非共价结合。ΜLM具有与泛素单体或二聚体同源的结构域,可以在E1-E2-E3酶联体系的催化作用下通过C末端的双甘氨酸基团与底物蛋白质共价结合,其代表成员有ISG15、FUB1、NEDD8、SΜMO、Urm1、UBL5、Ufm1和FAT10等。据文献报道,当复制过程中的细胞发生DNA损伤时,包括泛素化以及类泛素化在内的多种翻译后修饰通过修饰PCNA,对DNA损伤修复进行调控。当表皮细胞长时间暴露在紫外线(UV)辐射中,RAD6-RAD18复合体能够介导PCNA第164位赖氨酸残基发生高度的单泛素化,从而导致复制性DNA聚合酶发生变化。FAT10(HLA-F locus adjacent transcript 10)是一种大小为18k D的蛋白,其N段和C端都含有与泛素相似的结构域,其中N端序列相似率为29%,C端序列则有36%与泛素相同,它的主要作用是编码人主要组织相容性复合体(MHC)I类基因座。人源FAT10除了在成熟树突细胞,B细胞以及在一些免疫器官,譬如胸腺和脾中表达,也可以在各种组织中通过促炎症因子(IFN-γ,TNF-α)刺激而表达,通过其C-末端结合共价修饰靶底物发挥作用。在前期工作中我们通过质谱鉴定确定增殖细胞核抗原(PCNA)是FAT10的共价修饰底物。目的:通过研究DNA损伤修复过程中类泛素蛋白FAT10与PCNA共价修饰作用机制,以及验证细胞中FAT10是否共价修饰ENO1,找到一种新的影响DNA损伤修复和癌症发生发展的调控方式,为衰老生理学研究提供新的思路。方法:(1)用UV/IR和VP-16处理细胞,通过western-blotting以及q RT-PCR实验分别检测DNA损伤对FAT10蛋白和基因水平表达的影响;通过免疫共沉淀实验检测当DNA发生损伤时FAT10蛋白是否共价修饰PCNA;通过类泛素化降解实验以及si RNA敲低FAT10实验检测PCNA能否被FAT10通过26S蛋白酶体降解;通过细胞免疫荧光实验探究FAT10和PCNA之间相互作用的亚细胞定位情况以及PCNA被FATylation对细胞形成细胞核聚集点的影响。(2)构建p Flag-CMV-eno1和p CMV-Myc-fat10两种真核表达质粒,并将这两种质粒共转入HEK293细胞内,通过免疫共沉淀的方法,探究FAT10是否在细胞中共价修饰ENO1。结果:首先,我们用UV/IR和VP-16处理细胞,western-blotting以及q RT-PCR实验检测发生DNA损伤的细胞,结果显示,DNA损伤能从基因和蛋白水平诱导FAT10表达的上调,FAT10表达量随着DNA损伤程度加重而增加。在本次实验中,当UV辐射剂量达到20J/m2、IR辐射剂量达到20Gy或VP-16剂量达到200μM时,FAT10表达量最高。通过免疫共沉淀实验检测以10J/m2和20J/m2的UV辐照强度处理后的He La细胞,发现FAT10能够共价修饰PCNA。同样,我们观察到用IR辐照以及用VP-16处理细胞时,FAT10也都能够共价修饰PCNA。通过PCNA降解实验,我们发现随着细胞因子TNF-α和IFN-γ浓度升高,诱导产生的FAT10蛋白表达量逐渐增加,而PCNA的表达水平却逐渐降低;在加入26S蛋白酶体抑制剂——MG132处理的细胞中,PCNA的表达水平不变。同样,在VP-16处理后的细胞中,PCNA和FAT10的降解也可以被MG132抑制。将FAT10 si RNA转染到被VP-16处理后的细胞中,敲低内源性FAT10,发现PCNA的降解现象明显消失,这些结果表明当DNA损伤时,FAT10可以通过26S蛋白酶体介导PCNA降解。其次,我们分离出样品的细胞质和细胞核,并通过western-blotting检测PCNA和FAT10的表达情况,发现大部分PCNA在细胞核中积累,当添加26S蛋白酶体抑制剂后,细胞质中PCNA的积累显著增加,同时,FAT10在细胞核和细胞质中都显著积累。这些数据表明在VP-16处理后的细胞中,FAT10可能在细胞质中通过26S蛋白酶体介导PCNA降解。最后,我们通过激光共聚焦显微镜检测细胞核聚集点(nuclear foci),观察到FAT10和PCNA共定位在损伤位点,并且当使用VP-16处理细胞后,细胞核聚集点的数量增加,同时,细胞质中PCNA的表达水平降低。当添加MG132后,细胞核聚集点的数量减少,并且PCNA的表达水平恢复正常。这些实验结果表明在DNA损伤修复中,FAT10在胞质中介导PCNA降解从而影响细胞核聚集点数量增多。另外,我们通过构建p Flag-CMV-eno1和p CMV-Myc-fat10两种表达质粒,并将这两种质粒共转入HEK293细胞内,利用免疫共沉淀的方法,发现在细胞中FAT10能共价修饰ENO1。结论:我们推测细胞发生DNA损伤时能够诱导FAT10表达上调并能够共价修饰PCNA蛋白使之在细胞质中被26S蛋白酶体降解,从而使细胞核损伤位点数量增加。此外,我们还发现,类泛素蛋白FAT10在细胞中能共价修饰ENO1。以上结果提示,细胞发生癌变时,FAT10可能通过共价修饰PCNA和ENO1影响和调控肿瘤的发生和转移。