干旱与氮素利用效率低使用已成为限制作物生产的主要因素,挖掘与利用耐旱、高氮素利用率基因对优化作物生产有重要意义。本研究对烟草转录因子Nt WRKY65序列进行了系统的生物信息学分析,研究了Nt WRKY65转录因子在多种非生物胁迫和激素诱导胁迫下的表达差异,以及该转录因子的组织表达特性和亚细胞定位、创制了Nt WRKY65转录因子的过表达材料,探索了转录因子Nt WRKY65在干旱和低氮胁迫中功能,旨在为提高烟草品种耐旱性和氮素利用效率的分子改良提供新基因资源。主要结果如下:从K326中克隆获得Nt WRKY65的ORF全长为1761 bp,编码一个含303个氨基酸的蛋白,属于Ⅱ型WRKY转录因子家族,不具备跨膜结构。进化树分析显示该基因与林烟草、花烟草、绒毛状烟草的WRKY65同源性较高。亚细胞定位将Nt WRKY65转录因子编码蛋白定位在细胞核内。顺式作用元件分析显示该基因具有ABA、Me JA、低温、光照、防卫、厌氧和玉米醇溶蛋白等响应元件。q RT-PCR显示该基因在烟株上部叶、下部叶和小花冠（2cm）中优势表达。在干旱、低温和低氮胁迫下,Nt WRKY65的表达量显著上调。以K326为受体,构建带有35S启动子和GUS标记基因的p CAMBIA1305.1超表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法进行转基因,筛选鉴定并自交繁殖,得到不同的转基因株系,根据Nt WRKY65表达量的不同,获得4个T2代过表达转基因株系命名为OE1、OE2、OE3和OE4。以正常供水为对照,将在营养钵中培养6周的野生型K326（WT）和4个的OE株系烟苗,采用自然干旱方法进行12d处理后发现,OE植株的生物量（5.98g-6.25g）极显著的高于WT植株（4.01g）,叶片变黄程度、萎蔫程度均较轻,抗旱性水平较WT明显提高。OE株系的MDA、H~2O~2和O2-含量受到胁迫后显著低于WT植株,抗氧化酶活性显著高于WT植株;OE株系烟株叶片的ABA含量显著高于WT植株,OE株系的叶片的应激、干旱和ABA响应基因的相对表达量均显著提高,表明干旱诱导了该基因的表达,进而调控了干旱响应相关基因表达上调,表明转基因烟草表现出较好干旱胁迫的耐受性。以正常氮素处理（Na NO3 5.00mol/L）为对照,将培养5周的WT和4个的OE株系烟苗,在水培条件下进行低氮处理（Na NO3 0.25mol/L）14d后发现,OE株系烟株的干物质含量、根长、侧根数和总氮含量均显著高于WT植株,表现出明显的耐低氮性能。在低氮胁迫下,OE株系叶片的氮代谢关键酶活性、可溶性蛋白含量、硝酸盐含量均显著的高于WT植株,OE株系叶片的氮代谢相关基因表达量明显提高,衰老和类胡萝卜素降解相关基因表达量显著低于WT植株,表明转基因烟草在低氮条件的耐受性强。综上所述,转录因子Nt WRKY65在提高烟草对干旱和低氮胁迫的耐受性中有正向调控作用。