论文部分内容阅读
肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus)感染引起的一种自然疫源性疾病。HFRS起病急,发展快,死亡率高,分布范围广,严重危害着人类健康,曾被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)列为可经呼吸道传播的生物武器。利巴韦林(1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide)是公认的治疗HFRS有效的抗病毒药物,但由于毒副作用使其在临床上的应用受到了限制。盐酸阿比朵尔是一种免疫调节剂,对流感病毒、呼吸道合胞病毒等有包膜RNA病毒具有明显抑制作用。鉴于汉坦病毒亦是一种有包膜的RNA病毒,本研究拟将盐酸阿比朵尔应用于抗汉坦病毒研究。目的：运用流式细胞仪检测感染Vero E6细胞中汉坦病毒抗原的方法评价盐酸阿比朵尔体外抗汉坦病毒作用。建立汉坦病毒感染乳鼠模型,评价盐酸阿比朵尔灌胃给药对汉坦病毒感染乳鼠的保护作用,探讨盐酸阿比朵尔体内抗汉坦病毒作用及可能机制。方法：1、以汉滩病毒型特异性单克隆抗体(抗核蛋白抗体)A35为一抗,FITC标记羊抗鼠抗体为二抗建立流式细胞术(fluorescence-activated cell sorter, FACS)及间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence, IFA)检测汉坦病毒感染的Vero E6细胞中病毒抗原的表达。2、比较FACS及IFA法不同感染天数及不同病毒载量感染10d后汉坦病毒抗原表达的变化。3、MTT法检测盐酸阿比朵尔对Vero E6细胞的毒性。4. FACS及IFA法评价盐酸阿比朵尔感染前、后给药对汉坦病毒在Vero E6细胞中抗原表达的作用,及盐酸阿比朵尔对汉坦病毒的直接灭活作用。并以FACS.IFA法及半定量RT-PCR法检测5μg/mL盐酸阿比朵尔于-24h、-12h、Oh(感染时为0时)及2h作用细胞后汉坦病毒抗原及mRNA表达水平的变化。5、以不同剂量盐酸阿比朵尔对BaLb/C乳鼠灌胃10d,qd,评价盐酸阿比朵尔对BaLb/C乳鼠的毒性。6、建立汉坦病毒感染BaLb/C乳鼠动物模型；于感染前24h给乳鼠灌胃不同剂量的盐酸阿比朵尔10d,qd,通过评价感染后28d内乳鼠的生存率及平均生存天数(mean time to death, MTD)比较盐酸阿比朵尔对感染乳鼠的保护作用。7、分别于感染后4,8,12,及16d处死各组动物4只,取血清及肺、肾、脑组织；病理切片HE染色观察动物组织病变；冰冻切片检测病毒抗原表达变化；半定量RT-PCR检测病毒mRNA表达量的动态变化；ELISA检测血清中肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)及β干扰素(interferon-β)的动态变化。结果：1、将汉滩病毒(76-118株)常规接种至Vero E6细胞10d后,分别以不同稀释度的A35单克隆抗体与不同稀释度的FITC标记羊抗鼠抗体组合进行检测,一抗1：800与二抗1：400为最适组合稀释度进行FACS检测,一抗1：400与二抗1：400为最适组合稀释度进行IFA检测。2、病毒感染后48小时FACS检测到抗原阳性细胞百分数为2.6%,第10天达高峰,阳性细胞百分数为15.8%；间接免疫荧光法逐天刮片,感染后第3天可观察到阳性细胞,第10天可见阳性细胞最多,且荧光强度最强。流式细胞法能检出的最小病毒载量为50 PFU,抗原阳性细胞百分数为9.6%,间接免疫荧光法能检出的最小病毒载量为50 PFU。3、盐酸阿比朵尔对Vero E6细胞的毒性表现为细胞变圆、细胞壁增厚,脱落且OD570下降。其最大无毒浓度为8μg/mL,其半数无毒浓度(50% toxic concentration, TC50)为15.64μg/mL。4、感染前给药浓度组及感染后给药浓度组,病毒感染细胞阳性百分数、荧光强度随浓度增加下降,具有剂量效应,与病毒对照组比较,有统计学意义(p<0.05)；5μg/mL盐酸阿比朵尔在-24h、12h、0h、2h四个时间点作用细胞后,可明显降低病毒感染阳性百分数,具有时间效应；-24h12h作用后,病毒mRNA表达水平下降,与病毒对照组比较,有统计学意义(p<0.05)。5、3日龄内BaLb/C乳鼠灌胃盐酸阿比朵尔10d,qd,其半数致死剂量(50%lethal concentration, LD50)为78.42mg/kg/d,低于40mg/kg/d各剂量组动物未见明显体重减轻、死亡。6、汉滩病毒(76-118株)颅内接种感染BaLb/C乳鼠,感染10d后可见不同程度的临床表现：体重减轻、耸毛、尾鞭样改变、后肢瘫痪、衰竭死亡;10mg/kg/d及20mg/kg/d给药组可提高动物的生存率及MTD,发病时间及死亡时间延后,存活鼠于感染后28d体重恢复至正常,有剂量效应。7. 10mg/kg/d及20mg/kg/d给药组动物,感染后12d肺部病理改变明显减轻,肾脏及脑组织水肿、出血较安慰剂对照组减轻；感染后28d存活动物肺、肾、脑无明显病理改变。8、感染后12d,10mg/kg/d组及20mg/kg/d组动物肺部病毒抗原的表达明显下降,脑、肾组织抗原表达降低；感染后28d存活动物脑组织无特异荧光可见,肺及肾中未见荧光细胞。9、感染后4d,各组动物的肺、肾及脑组织均无病毒mRNA检出；感染后8d,各剂量组肺组织中病毒mRNA表达明显下降,呈剂量效应(p<0.05),10mg/kg/d组肾病毒mRNA表达下降(p<0.05)；感染后12d,20mg/kg/d组肺组织中病毒mRNA表达明显下降(p<0.05),各用药组动物肾组织中病毒mRNA表达明显高于安慰剂对照组(p<0.05),脑组织半定量RT-PCR结果显示,5mg/kg/d组及20mg/kg/d组病毒mRNA表达明显高于安慰剂对照组(p<0.05)；感染后16d,10mg/kg/d组及20mg/kg/d组动物肺组织中未检出病毒mRNA,5mg/kg/d组动物的病毒mRNA/β-actin比值为0.24,安慰剂对照组为1.05,各剂量组脑组织中病毒mRNA/β-actin比值明显下降,具有剂量效应(p<0.05)。安慰剂对照组肾组织中病毒mRNA/β-actin比值为0.88,20mg/kg/d组肾组织中病毒mRNA/β-actin比值降为0.24(p<0.05)。10、病毒分离结果显示,感染后4d,各组动物的肺、肾及脑组织均无感染性病毒颗粒检出；经盐酸阿比朵尔治疗后,肺组织中病毒滴度明显下降,具有时间和剂量效应；感染后16天,20 mg/kg/d治疗组动物肾组织中病毒滴度下降,与对照组比较,有统计学意义(p<0.05),脑组织中病毒滴度降低10-100倍,呈剂量效应。感染后28天,存活动物组织中未分离到有感染性病毒颗粒。11、ELISA检测血清中TNF-α,感染后4d,安慰剂对照组血清中TNF-α含量为183.58 pg/mL,正常动物血清中TNF-α含量为79.56 pg/mL,与安慰剂对照组比较,各剂量组动物清中TNF-α含量明显下降,呈剂量效应(p<0.05)。感染后8,12及16d,10mg/kg/d组及20mg/kg/d组动物血清中TNF-α含量在30-80 pg/mL范围内,安慰剂对照组血清中TNF-α浓度低于最低检测限(15.63pg/mL)。所有样本中IFN-β检出量均低于78pg/mL。结论：1、流式细胞检测法作为一种检测培养细胞内汉坦病毒抗原的方法具有灵敏快速的特点,与IFA法比较,可以更直接准确定量。2、盐酸阿比朵尔体外具有抗汉坦病毒效应,在病毒进入细胞前及细胞后均有抑制作用,不同时间用药以病毒进入细胞前作用更明显。3、盐酸阿比朵尔对汉坦病毒致死性感染BaLb/C乳鼠具有保护作用。