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由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn) AG1-IA融合群引起的水稻、玉米纹枯病是作物生产上的主要病害,随着种植面积的扩大和高产栽培技术的推广,该病害发展蔓延加快,就发病范围及面积而言已成为水稻、玉米第一大病害。培育种植抗病品种是生产上综合治理作物病害的首选策略,但由于高抗材料(主效抗病基因资源)的缺乏限制了纹枯病的抗性育种。本研究通过鉴定水稻和玉米纹枯病抗病相关基因及纹枯病菌诱导启动子,对进一步研究玉米的抗病机制以及利用调控抗病相关基因表达改良水稻和玉米对纹枯病的抗性具有重要的科学意义和应用前景。 本研究报道的水稻基因Os2H16不仅能够被纹枯病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌等病原微生物所诱导,还能被盐和干旱胁迫诱导。超量表达Os2H16基因增强了水稻对纹枯病菌和白叶枯病菌的抗性并伴随有PR基因的激活,抑制表达Os2H16基因使得水稻对纹枯病菌和白叶枯病菌更加敏感,同时PR基因的表达也受到抑制。这些结果说明Os2H16可能是通过影响防御相关基因的表达来影响水稻的抗性。超量表达0s2H16提高了水稻对干旱的耐受性并伴随有干旱相关基因的激活,而抑制表达Os2H16的植株则受到干旱胁迫的损害,干旱相关基因的表达也受到抑制。同时在超量表达植株中,脱落酸诱导相关基因的表达在干旱处理后也被上调表达,而在脱落酸不敏感突变体Osbzip23中,Os2H16基因的表达受到抑制。这些结果说明Os2H16通过脱落酸信号途径介导水稻对干旱的耐受性,并且位于OsbZIP23的下游。 Os2H16基因启动子是一个能够被纹枯病菌、白叶枯病菌和细菌性条斑病菌诱导的病原诱导表达启动子。启动子系列截短缺失实验表明,-513 bp至-411 bp的缺失可以部分影响启动子受病原菌的诱导表达,说明在这一区段内存在正向调控病原菌诱导表达的元件;而-411 bp至-309 bp的缺失导致了启动子受病原菌诱导表达程度的急剧下降,几乎使其丧失了对病原菌的响应,说明在这一区段内存在病原菌诱导表达的核心响应位点。通过PLACE对这两个区段的DNA序列分析发现,在-513bp至-411 bp区域内没有发现已知的病原诱导相关元件,说明存在可能新的调控序列来正向调控病原菌的诱导表达。而在-411 bp至-309 bp区域内存在两个GT-1元件,其中GT-1(GAAAAA)是一个受病原菌和盐胁迫诱导的作用元件。利用酵母单杂交技术筛选得到与GT-1互作的两个互作蛋白EF576160和CM000130,验证了两个互作蛋白与GT-1的结合,并均具有转录因子的功能。其中EF576160编码脱落酸胁迫成熟蛋白2,该基因能够被盐胁迫及脱落酸诱导并且通过脱落酸信号途径介导植物对干旱和盐胁迫的耐受性,这也就可以解释Os2H16基因通过脱落酸信号途径调控水稻对干旱的耐受性;CM000130编码一个未知功能的蛋白,具有WD40保守结构域。这两个互作蛋白的编码基因都能够受白叶枯病菌和纹枯病菌的诱导表达,说明其可能参与了对白叶枯病和纹枯病的抗性反应。 病原菌侵染后能够激发抗病相关基因的表达,这些抗病相关基因在提高作物抗病性中是非常重要的资源。高通量测序技术能够轻易地挖掘大量抗病相关基因,但是探究这些基因在植物抗病和感病过程中的作用仍然是一个难题。本研究通过弱致病力菌株YWK62和强致病力菌株YWK196与玉米的互作,完成了三组转录组测序并进行了重复性验证,结合两次测序数据,与对照相比受YWK62调控的差异表达基因有1086个,受YWK196调控的差异表达基因有642个,同时受YWK62和YWK196调控的差异表达基因有298个,包括166个上调表达基因和132个下调表达基因。在这些基因中有22个定位在了已知的纹枯病抗性QTLs中,并且在50个随机选取的基因中有41个基因的表达通过定量RT-PCR得到了证实。在水稻中超量表达9个随机挑选的基因影响了水稻对YWK196的抗性,其中超量表达7个基因增强了水稻的抗性,超量表达2个基因增强了水稻的感病性。超量表达上调基因的表型与这些基因在YWK62和YWK196侵染后的表达存在一定相关性,根据这些结果我们假设了一个模型:受到YWK62更强诱导表达的基因正向调控植物的抗病反应,相反受到YWK196更强诱导表达的基因则负向调节植物的抗病反应。这个新模型能够帮助我们从大量测序数据中来区分抗病相关基因并且便于分析基因的功能,尤其是对于那些未知功能的基因。 对4个受纹枯病菌诱导表达基因的启动子研究发现,这4个启动子表现出丰富的组织表达模式并且在24 h内就能够被YWK196高效诱导。通过启动子缺失实验,我们确定了各启动子受YWK196诱导的核心区域,通过PLACE对这些核心区域分析发现,有些区域中含有GT-1元件,结合水稻Os2H16基因启动子的研究结果说明,GT-1在植物体内介导了一条保守的病原菌响应途径;还有的区域内包含有激发子响应元件和W-box,同时还鉴定到了含有未知元件的病原诱导区域(4个)。这些结果说明玉米对纹枯病菌的响应是受体内一系列复杂信号调控的。 综上所述,本研究共鉴定了10个纹枯病抗性相关基因和5个受纹枯病菌诱导的启动子,明确了其抗性功能或受病原菌诱导调控的区间。相关研究结果为进一步分析纹枯病数量抗性网络及抗病基因工程改造提供了候选目标。