论文部分内容阅读
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为主要病理特征,同时伴有关节软骨破坏和软骨下骨侵蚀的全身性自身免疫性疾病。RA滑膜成纤维细胞(RA synovial fibroblasts,RASFs)的活化是上述病理过程的重要参与者。有证据表明Wnt/β-catenin信号通路在RA中处于激活状态,参与了RASFs的活化。活化的SFs具有增殖,侵袭力增强,炎症因子分泌异常,类肿瘤样生长特性。转录因子Forkhead box C1(Fox C1),近年来发现在多种肿瘤的发生机制中异常表达且在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭方面发挥重要作用。尽管在肿瘤中已有关于Fox C1的报道,但目前在RA中还缺少关于Fox C1表达及功能的相关研究。因此,本研究着重探讨Fox C1在RA滑膜组织和RASFs中的表达情况以及Fox C1对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响的相关分子机制。本实验共分为四个部分。一、Fox C1和β-catenin在RA滑膜组织及RASFs中高表达获取RA和正常创伤组(Control)患者的滑膜组织,通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、蛋白质印记(western blot,WB)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)等方法检测Fox C1和β-catenin的表达情况。结果发现:RA滑膜组织中的Fox C1,β-catenin基因和蛋白的表达明显高于Control患者。另外,从滑膜组织中提取原代SFs后进行检测,结果同样显示:Fox C1和β-catenin在RASFs中的表达高于Control SFs。滑膜组织的IHC和SFs的免疫荧光检测结果显示:Fox C1和β-catenin在SFs的细胞质和细胞核中均有表达,并且在细胞核中Fox C1和β-catenin的表达量明显高于Control组。这部分结果提示Fox C1和β-catenin在RA病理中异常表达。二、Fox C1调控RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌为了进一步探究Fox C1在RA中的功能,提取原代RASFs并通过转染过表达Fox C1的慢病毒,观察其对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响。结果发现:在体外过表达Fox C1的RASFs的增殖、迁移、侵袭能力明显增强;通过酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)发现:过表达Fox C1能够增加RASFs上清中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌,同时降低白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)的分泌。通过转染抑制Fox C1表达的si RNA片段,观察其对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响。结果发现:在体外抑制Fox C1的RASFs的增殖、迁移、侵袭能力明显减弱;通过ELISA检测发现:抑制Fox C1可降低RASFs上清中的IL-1β、IL-6及TNF-α分泌,同时促进IL-10的分泌。三、Fox C1通过调控β-catenin激活Wnt/β-catenin信号通路影响RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌结合上述结果,我们推测Fox C1调控RASFs的增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌,很有可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路。因此,我们应用WB和q RT-PCR方法对与Wnt/β-catenin通路相关,以及RA病理相关的基因进行检测,结果发现在RASFs中过表达Fox C1后可促进Wnt/β-catenin通路重要的信号分子β-catenin的表达,同时与Wnt/β-catenin通路相关的基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、原癌基因(c-Myc),以及RA相关的基因纤连蛋白(fibronectin)和基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)的表达都升高。然而这一现象在抑制Fox C1的表达后出现了相反的结果。为了进一步明确Fox C1可能是通过调控β-catenin来影响Wnt/β-catenin通路并实现上述功能。接下来我们进行正反验证。首先在过表达Fox C1的情况下同时抑制β-catenin,发现cyclin D1,c-Myc,fibronectin和MMP3的基因和蛋白表达都降低;RASFs的增殖、迁移、侵袭以及促炎症因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)分泌抑制,抗炎因子(IL-10)的分泌增加。其次我们在抑制Fox C1的情况下过表达β-catenin,发现cyclin D1,c-Myc,fibronectin和MMP3的基因和蛋白表达都升高;RASFs的增殖、迁移、侵袭以及促炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)分泌增加,抑炎因子(IL-10)的分泌降低。最后,通过免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation,COIP)我们发现:Fox C1蛋白在RASFs中与β-catenin蛋白存在结合。进一步通过双荧光素酶实验和染色质免疫共沉定技术(chromatin immunoprecipitation,CHIP)发现:在RASFs中Fox C1与β-catenin启动子结合,促进β-catenin的转录。四、体内抑制Fox C1能够降低胶原诱导关节炎大鼠(collagen-induced arthritis,CIA)模型的关节炎进展建立CIA模型14天后,我们在大鼠的左后踝关节中注射能够抑制Fox C1表达的si RNA(Fox C1-specific si RNA),通过活体成像确定一次注射药物在体内能够有一周的有效时间。干预治疗3周后,通过HE染色、IHC、Micro-CT、番红固绿染色分别评价Fox C1-specific si RNA对于CIA大鼠的滑膜、骨和软骨的治疗作用。我们的结果显示Fox C1-specific si RNA能够缓解CIA大鼠的关节炎进展。综上所述,我们的研究从体外和体内两个系统,全面探讨了Fox C1在RASFs中的表达以及对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子的影响。发现Fox C1之所以能发挥这些作用,是通过调控Wnt/β-catenin途径中重要的信号分子β-catenin。最后,我们证实局部抑制Fox C1的表达能够缓解CIA大鼠的关节炎进展。Fox C1的发现为理解、探索RA的病理机制提供了重要线索,同时为寻找RA新的治疗靶点提供新的思路。