龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属无患子科常绿热带亚热带木本果树,其胚胎发育状况与果实的大小和风味密切相关。龙眼胚胎发育的研究依赖于龙眼胚性系统的建立,体细胞胚胎和合子胚胎是目前最常见到的胚胎系统。自然状态下龙眼合子胚多为杂合基因型,遗传背景解析困难,且合子胚形成依赖树体发育,周期长,外部包被果肉,难以获得持续的材料且不易观察,极大限制了胚胎发育的研究。体细胞胚胎建成过程与合子胚高度相似,可在体外培养,纯和度高,便于研究取材和在细胞分子水平进行机理阐释。本文以龙眼体细胞胚胎发生早期材料为研究对象,重点关注龙眼胚性愈伤组织（Embryogenic Callus,EC）到球形胚（Globular embryos,GE）的形成过程,设置不同的温度条件（15℃、25℃和35℃）探讨龙眼体细胞胚胎形成早期对温度的响应机制,并在此基础上构建龙眼体细胞胚胎响应温度变化的转录组和s RNA数据库,筛选差异基因富集路径可变剪接和牛磺酸代谢进行后续分析,本研究还针对龙眼温度响应的特异热激蛋白（Heat Shock Protein 20,HSP20）和可变剪接体的调节子精氨酸/丝氨酸富集蛋白（arginine/serine-rich protein,SR）进行基因家族分析,选取表达模式差异的SR关键基因进行克隆和转基因功能研究。主要结果如下:1.龙眼体胚形成早期形态、激素、可溶性糖和牛磺酸的含量均响应温度变化本研究首先利用显微观察分析了常温（25℃）下龙眼EC到GE的发育过程,明确了自然培养状态下龙眼EC到GE的发育进程。接着分析了不同温度（15℃、25℃和35℃）对龙眼从EC到GE发育过程的影响,并用细胞还原（triphenyl tetrazolium chloride,TTC）法测定不同温度下龙眼体细胞胚胎的活力。结果表明,相对于常温（25℃）培养,相对高温（35℃）和相对低温（15℃）都不利于球形胚的形成。相对高温下,龙眼EC的增殖速度快,短时间内可以维持一定的细胞活力,长时间下细胞活力受损;相对低温下,龙眼的增殖速度慢,细胞活力维持较好,但二者都难以形成肉眼可见的球形胚。进一步利用酶联免疫法对不同温度下生长的龙眼细胞进行激素包括生长素（Indole-3-acetic Acid,IAA）、细胞分裂素（Cytokinin,CTK）和褪黑素（Melatonin,MT）的分析测定,结果表明,三个温度条件下,IAA和CTK的比例都维持在～1.5,没有发生变化。然而不同温度条件下龙眼细胞中的激素含量都发生了差异,在相对低温下,测定的激素IAA、CTK和MT的含量都较常温高,相对高温并没有改变龙眼细胞中IAA和CTK的含量,但是MT的含量却显著低于常温,这说明,MT可能与龙眼体细胞球形胚的形成有关。此外,不同温度条件下龙眼细胞中的可溶性糖和牛磺酸的含量也存在很大差异,相较于常温,相对高温和相对低温下龙眼细胞中可溶性糖含量明显升高,而牛磺酸含量则明显降低,推测龙眼体细胞球形胚的形成与可溶性糖和牛磺酸的含量有关2.龙眼体胚发生早期响应温度变化的转录组和s RNA数据库构建和分析为了进一步探讨龙眼体胚发生早期响应温度变化的机制,本研究选择不同温度下处理24h的龙眼细胞构建转录组文库EC15、EC25和EC35,各文库均包括三个生物学重复,原始数据量均达到6.5 G,各文库中获得的高质量序列与基因组匹配率为73.27%-75.47%,Q30值达到92.25%。该转录组共检测到27,260个基因表达,其中已知的基因数为25,267个,预测的新基因为1,633个。EC15和EC35共有10,747个差异表达基因,其中5466个上调,5281个下调;EC25和EC15共有3,696个差异表达基因,其中1,639个上调,2,057个下调;EC25和EC35共有3,135个差异表达基因,其中1,644个上调,1,491个下调。差异表达基因GO功能分类结果为生物工程、细胞成分和分子功能,分别包含20、12和14个子分支,GO富集的路径体现在核糖核蛋白合成、钠质子转运体和寡糖转移酶复合体。KEGG功能分析结果表明,大部分差异基因涉及碳水化合物代谢,且富集系数最高的途径都是牛磺酸和亚磺酸代谢,富集差异基因最多的代谢途径是可变剪接体,说明牛磺酸和亚磺酸代谢及可变剪接对不同温度下龙眼EC的生长发育具有重要调控作用。在对转录组数据库EC15、EC25和EC35的分析中鉴定到大量热激蛋白的合成基因HSP20差异表达,对转录组中测到的42个龙眼HSP20基因家族成员进行理化性质、亚细胞定位、染色体定位、β折叠数量、系统进化、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件、表达模式及可变剪接事件等分析发现,大部分成员的分子量介于15-30 k Da之间。除7号染色体上没有分布外,在其它14条染色体均有分布。每个成员平均含有62个β折叠,比理想的ACD结构域含有的β折叠数量多出数倍。龙眼和拟南芥HSP20基因家族亲缘关系很远,猜测HSP20基因在长期进化过程中形成了相对不保守的基因家族,其在功能行使过程中对外界刺激响应的敏感性及抵御胁迫的能力等方面可能有所差异。所有成员启动子中均含有大量功能未知的顺式作用元件,说明HSP20基因还有很多功能未被挖掘;在已知功能的顺式作用元件中,大部分成员胁迫响应元件最多,说明HSP20在植物抗逆方面具有重要作用。Dlo-HSP22.7、Dlo-HSP17.4、Dlo-HSP17.6、Dlo-HSP35.6、Dlo-HSP16.2和Dlo-HSP18.3A共6个HSP20基因的荧光定量结果说明龙眼细胞对相对高温和相对低温环境均会响应。此外,对HSP20基因家族进行可变剪接分析发现5’可变剪接（alternative 5’splice site A5SS）事件发生更为普遍,猜测其在龙眼EC响应热胁迫时可能具有重要的调控作用。转录后调控广泛存在于植物体胚发生过程中,为了探究龙眼体胚发生早期响应温度变化的转录后调控机制,本研究在转录组分析的同时也分别以EC15、EC25和EC35为材料建立了s RNA数据库,各包含三个生物学重复,各数据库分别产生了23.35-25.13M的原始数据,与已知s RNA数据库比对上的比例介于91.46%-92.14%,且测序数据Q20高达99%。对这些数据库的分析比对发现,鉴定出的s RNA种类包括mi RNA、si RNA、r RNA、sn RNA、sno RNA、t RNA等,且s RNA的长度以24 nt为主。共鉴定出156个mi RNA,表达量各异。以TPM对表达量进行均一化后发现mi R398b、mi R159a、mi R171f、mi R166a、mi R397a、mi R156a、mi R162a和mi R408等大量表达。通过温度处理后,差异显著表达的mi RNA有mi R170-5p、mi R162a、mi R168-5p、mi R408-5p和mi R398b等。通过q RT-PCR对mi R398b前体及其靶基因Dlo CSD1a在不同温度处理过程中的表达分析发现,与常温下的表达量相比,相对低温下mi R398的前体表现为先上升后下降的表达趋势,相对高温下mi R398的前体表现为“升降升”表达趋势;而相对低温下Dlo CSD1a表现为“降升降”的表达趋势,相对高温下Dlo CSD1a表现为先升后降的表达趋势。pre-mi R398b的表达模式与其靶基因Dlo CSD1a的表达模式并不完全呈相反趋势,说明mi R398在龙眼细胞响应高温和低温变化中的作用机制可能存在差异。3.龙眼可变剪接体调节子SR基因的鉴定与分析鉴于对龙眼EC响应温度变化的转录组数据分析结果发现,差异表达基因富集到最多的代谢途径是可变剪接体,因此本研究接下来对调控可变剪接的SR基因家族进行了全基因组鉴定和分析,结果表明,龙眼中共有21个SR基因家族成员,分为RSZ、RS、SC、SCL、RS2Z和SR 6个亚家族,其中RS、RS2Z和SCL三个亚家族是植物所特有的。通过对其理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点、系统进化、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件、表达模式、可变剪接事件及部分成员与拟南芥的蛋白互作等分析发现,龙眼与拟南芥SR基因家族在进化上相对保守,其不同亚家族在进化过程中既有保守性,又有一定的特异性,说明SR基因家族是一个相对保守的基因家族。龙眼SR基因家族含有多个与生长发育、植物激素、胁迫有关的顺势作用元件。此外,龙眼体胚发生早期可变剪接事件的分析结果表明不同类型的可变剪接事件在体胚发生的不同阶段所起调控作用的重要性不同,随着发育进程的进行,可变剪接事件的发生频率越高。4.龙眼中关键差异表达SR基因的克隆、表达分析和功能验证通过龙眼SR全基因组分析,获得了表达模式各异的SR基因家族成员Dlo RS43、Dlo SC18、Dlo RS2Z32和Dlo-SR30。为了对这些基因的功能进行深入研究,本研究通过RACE获得以上SR基因的c DNA全长。成功构建p CAMBIA1301-35S-Dlo RS43-GUS、p CAMBIA1301-35S-Dlo SC18-GUS、p CAMBIA1301-35S-Dlo RS2Z32-GUS和p CAMBIA1301-35S-Dlo SR30-GUS过表达载体,并通过浸花法转化拟南芥后获得转基因植株。不同光照处理下龙眼SR基因的表达模式存在差异;通过对白光和蓝光处理下EC中SR的表达模式分析发现,Dlo-SR33对蓝光响应敏感。龙眼SR基因不同成员在同一组织部位和不同组织部位的表达不尽相同,部分SR基因呈现组织特异性表达,说明不同SR家族成员在龙眼生长发育过程中的功能存在差异。对SR基因家族成员在龙眼不同组织部位中的表达模式分析发现一些SR基因呈现组织特异性表达,且同一亚家族不同成员在同一组织中的表达模式也不尽相同;体胚发生早期龙眼SR基因荧光定量实验结果说明SR基因在龙眼不完全胚性紧实结构（incomplete compact pro-embryogenic cultures ICp EC）到GE阶段具有重要调控作用。通过对Dlo RS2Z24、Dlo RS2Z32、Dlo SC18、Dlo SR30、Dlo SR33和Dlo RS43在不同温度下龙眼体胚发生早期的表达情况进行测定分析发现不同SR基因对温度响应的模式不同,总体上,龙眼细胞对低温的响应强于高温,具体而言,相对低温下Dlo SC18和Dlo RS43的表达都较常温下升高,Dlo SR33的表达仅在第5d时升高,其余时间点低于常温,Dlo RS2Z32和Dlo SR30则与常温下差异不大,仅Dlo RS2Z32在第1d低于常温,Dlo SR30在第7d表现出降低。相对高温下,Dlo RS2Z24、Dlo SR30和Dlo RS43的表达总表现出不同程度的下降,Dlo SR33的表达却高于常温,Dlo SC18则为先下降后升高。SR基因响应高低温模式的不同说明其在龙眼EC发育为GE过程中存在不同的调控机制。利用Dlo RS43、Dlo SC18、Dlo RS2Z32和Dlo SR30转基因过表达植株的GUS来对SR进行定位分析,结果表明,Dlo SC18和Dlo SR30在根、茎、叶上均能着色,但在每个部位的着色程度有所差异,Dlo RS2Z32主要在根和茎中着色,而Dlo RS43主要在根中着色。无论在哪个部位,从着色程度来看,Dlo SC18和Dlo SR30植株的表达量都远高于Dlo RS2Z32和Dlo RS43植株。对转基因植株表型分析发现过表达Dlo RS43后,转基因植株根部的生长受到明显抑制,说明Dlo RS43对植物根的发育起重要作用。综上所述,本研究通过生理生化、细胞学、分子生物学和组学分析等方法,结合模式植物拟南芥等的研究,较为全面地阐述了龙眼体细胞球形胚形成过程中响应不同温度的方式和作用机制。本研究结果对明确龙眼细胞温度响应机制及其体细胞胚再生体系的完善具有理论指导意义,为龙眼果实的发育和风味的改善以及优良品种的生物技术育种奠定了基础。