背景:在器官移植受者中,Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染可诱导致死性移植术后并发症——移植后淋巴增殖性疾病(post-transplant lymphoproliferative disorders,PTLD)的发生,严重影响受者和移植物的预后。EBV是一种人类γ疱疹病毒,也是人们发现的首个致瘤病毒,其感染与一些恶性肿瘤的发生发展密切相关,包括B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等淋巴细胞或上皮细胞来源的恶性肿瘤。在免疫抑制如医源性免疫抑制的情况下,EBV的致瘤风险大大上升。另一种常见的人类γ疱疹病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)也是重要的致瘤病毒。γ疱疹病毒致瘤机制复杂,阐明病毒和宿主之间的相互作用和调控机制对认识和治疗相关恶性肿瘤意义重大。EBV和KSHV由于其种属特异性只能感染人类或部分灵长类动物,不利于体内实验的开展,且EBV和KSHV缺乏可进行有效的体外裂解性复制的细胞系,极大地限制了病毒的研究工作。鼠γ疱疹病毒68(murine gammaherpesvirus 68,MHV-68)同属γ疱疹病毒亚科,在基因序列上与EBV和KSHV高度同源,其生物学特性也与EBV和KSHV高度相似,既可在多个实验室常用细胞系中建立体外感染模型,也可稳定感染小鼠建立有效的体内感染模型,因此MHV-68是研究人类γ疱疹病毒的常用模型。本课题旨在研究宿主蛋白对MHV-68裂解性复制的调控,进一步认识病毒-宿主相互作用,为致瘤性γ疱疹病毒相关肿瘤的预防和治疗提供支持。方法:构建包含千余种细胞激酶和细胞转录因子的c DNA文库,系统性筛选出调控MHV-68裂解性复制的宿主蛋白,根据其促进或抑制裂解性复制将其分为促进因子和限制因子。利用STRING、Metascape等数据库探究病毒裂解性复制相关的蛋白功能、相互作用和信号转导通路。将23种细胞蛋白进行两两共表达,探究相关因子在病毒裂解性复制中的交互影响。我们对促进因子酪氨酸蛋白激酶7(protein tyrosine kinase 7,PTK7)进一步深入研究,检测其对病毒裂解性基因转录和表达、基因组复制和子代病毒产量的影响,分析其作用机制。结果:本研究共筛选出105个MHV-68裂解性复制的促进因子(54个细胞激酶,51个细胞转录因子)和164个限制因子(66个细胞激酶,98个细胞转录因子),涉及多条重要信号通路。通过构建蛋白-蛋白相互作用网络,发现167个调控因子之间存在417对相互作用关系。MAP3K5+Fos、MAP2K3+Fos、MAX+Fos等共表达组合在调控病毒裂解性复制中表现出协同效应,显著增强裂解性复制,而过表达CREB1和Myc则拮抗大多数促进因子对病毒裂解性复制的增强作用。MHV-68裂解性复制的促进因子PTK7的过表达不影响病毒裂解相关基因的转录和表达,不影响病毒基因组复制,但可促使细胞向胞外释放病毒。PTK7这种促病毒释放作用同样适用于一种α疱疹病毒——人类单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus type 1,HSV-1)。结论:本研究通过高通量筛选系统性分析了细胞激酶和细胞转录因子对MHV-68裂解性复制的调控作用,提供了大量分子水平和细胞水平的研究靶点。这些调控因子可能作用于病毒裂解复制的不同阶段,如裂解基因表达、病毒DNA复制、病毒组装和释放等。我们进一步研究了其中一个调控因子PTK7,发现PTK7促进宿主细胞释放MHV-68,且这种作用可能适用于所有疱疹病毒。本研究为病毒裂解性复制的调控机制提供了新的成果和认知,有利于γ疱疹病毒致瘤机理的研究、抗病毒药物的研发和PTLD等相关肿瘤治疗策略的制定。背景:γ疱疹病毒在宿主内的感染、复制和繁殖有赖于多种宿主蛋白的参与。大量的研究发现,宿主细胞蛋白既直接结合(物理性相互作用)KSHV、EBV或MHV-68的病毒蛋白来显著影响病毒的裂解性复制,也可以通过功能性相互作用进行调控。但大多数研究主要局限于对病毒裂解性复制起始或早期阶段的研究,在细胞蛋白影响裂解性复制其他阶段如病毒DNA复制、晚期基因表达,病毒组装和病毒释放等方面的研究极其有限。本研究希望能系统性筛选出影响病毒裂解性复制各个阶段的相关宿主蛋白。方法:我们构建了包含近350种细胞激酶和700种细胞转录因子c DNA文库。HEK293T细胞转染表达质粒后感染携带有荧光素酶表达元件的重组型MHV-68报告病毒,检测荧光素酶活性(代表感染性病毒产量)。利用STRING数据库构建宿主蛋白-蛋白相互作用网络,利用Metascape数据库对这些调控性蛋白进行细胞信号通路和生物学过程富集分析。我们还选取了23种调控疱疹病毒感染的细胞蛋白,检测两两共表达下病毒裂解性复制的变化。结果:本研究共筛选出105个MHV-68裂解性复制的促进因子(54个细胞激酶,51个细胞转录因子)和164个限制因子(66个细胞激酶,98个细胞转录因子)。细胞通路富集分析发现在促进因子组,MAPK信号通路、Erb B信号通路、Fox O信号通路以及Gn RH信号通路等显著富集。在限制因子组,Fox O信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和Ras信号通路为主要富集通路。通过构建蛋白-蛋白相互作用网络,发现167个调控因子之间存在417对相互作用关系,并筛选出8个紧密联系的蛋白群组,与基因转录和蛋白运输、定位、活性调控等密切相关。宿主蛋白两两配对共表达发现MAP3K5+Fos、MAP2K3+Fos、MAX+Fos等共表达组合在调控病毒裂解性复制中表现出协同效应,显著增强裂解性复制,而过表达CREB1和Myc则拮抗大多数促进因子对病毒裂解性复制的增强作用。结论:病毒在感染宿主过程中,受到宿主细胞内多种因子和信号通路的影响。本研究通过系统性筛选出269个参与调控MHV-68裂解性复制的细胞激酶和细胞转录因子,并初步探索了宿主蛋白间的相互作用和宿主信号通路在病毒裂解性复制中的作用,为进一步研究宿主-病毒相互作用提供了方向。背景基于第一部分的高通量筛选结果,我们发现PTK7促进MHV-68裂解性复制。PTK7是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)家族成员,参与多项细胞信号转导通路,影响细胞的生长、分化、增殖、运动、凋亡,在脊椎动物的胚胎发育和肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本部分研究探究PTK7如何调控MHV-68病毒的裂解性复制。方法:HEK293T细胞转染不同剂量的PTK7表达质粒后感染携带有荧光素酶表达元件的重组型MHV-68报告病毒,收集上清检测荧光素酶活性。野生型(wild type,WT)MHV-68病毒感染表达PTK7的细胞后,在不同时间点检测病毒裂解基因的转录水平、DNA拷贝数以及裂解性蛋白表达量。低感染复数(multiplicity of infection,MOI)下感染细胞,多个时间点收集上清检测荧光素酶活性,构建病毒在过表达PTK7、阳性对照Tpl2和空白对照空载体的三种细胞中的多步生长曲线。并根据多步生长曲线,在病毒感染48小时时,我们分别检测上清中、细胞中、上清加细胞中的病毒的滴度。我们还构建了短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒载体干扰PTK7的表达,检测胞内活病毒量的变化。此外,我们检测了过表达PTK7后HSV-1在胞内、胞外的病毒量和总病毒量。结果:PTK7对MHV-68裂解性复制的促进作用呈剂量依赖性。PTK7的过表达不影响病毒裂解相关立即早期、早期、晚期基因的转录和表达,不影响病毒基因组的复制,但可促使细胞向胞外释放病毒。抑制PTK7的表达可明显减弱病毒释放。PTK7这种促病毒释放作用同样可见于α疱疹病毒HSV-1。结论:PTK7的研究结果揭示了其对疱疹病毒裂解性复制终末阶段病毒的释放的调控作用。这既佐证了第一部分的高通量筛选的有效性和意义,即其可一次性筛选出相当数量的作用于病毒裂解复制的不同阶段的宿主蛋白,也为疱疹病毒及相关肿瘤的治疗提供了新的靶点。