研究背景和目的前体细胞，又称为干细胞，是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，前体细胞的自我更新和分化受到严格调控，如果这种调控机制发生障碍，细胞就会相对无止境地生长、繁殖，形成肿瘤。由此可知，正常前体细胞可能通过累积基因突变获得不确定的分裂繁殖能力，转化为肿瘤前体/干细胞（tumor-initiatingcells/cancer stem cells，T-ICs/CSCs）。肿瘤前体细胞是存在于肿瘤组织中的少部分具有干细胞性质的细胞群，具有自我更新能力和不确定分化程度的潜能，是形成不同分化程度的肿瘤和肿瘤不断生长扩散的根源。肿瘤前体细胞学说的提出是人类认识肿瘤本质的一大进步，为肿瘤的发病机制、早期诊断以及恶性肿瘤根治方法的研究提示了新的方向。目前在人急性粒细胞白血病细胞、乳腺癌细胞和脑肿瘤细胞中发现并已分离出肿瘤前体/干细胞。然而，对于肿瘤前体细胞的调控机制存在着不同的理论，被广泛接受的是异常信号传导通路、非整倍核型发生、原癌基因激活与抑癌基因失活和端粒酶耗损理论等。所以，进一步研究肿瘤前体细胞的调控机制将有助于揭示肿瘤形成的分子机制，有助于寻找针对肿瘤前体细胞进行肿瘤治疗的多个靶位，为根治恶性肿瘤提供新的治疗思路。2000年Fujita等通过差减杂交法从人的肝癌组织cDNA文库中发现，p28^GANK是一个在人肝细胞癌组织中相对特异性高表达的癌基因；目前新发现该基因还高表达于人食管鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌以及肺癌。近年来发现p28^GANK基因编码的蛋白是人26S蛋白酶体（26S proteasome）调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基，它与CDK4结合并参与CDK4/CyclinD1/p16INK4α/Rb1/E2F-1信号转导通路的调节，驱动肿瘤抑制蛋白Rb1的核内磷酸化失活和E2F-1的释放，促使细胞由G1期向S期转化，进而紊乱了细胞周期；而且外源性转入癌基因p28^GANK使其高表达的NIH/3T3细胞株可以使裸鼠荷瘤。最近，Nagao等人通过酵母双杂交发现黑色素瘤抗原MAGE-A4能与癌蛋白p28^GANK特异性结合并抑制p28^GANK成瘤活性。此外，癌蛋白p28^GANK能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用，调节P53的泛素化及降解，进而抑制P53介导的细胞凋亡。临床统计提示，癌蛋白p28^GANK的表达水平与肝癌及食管癌患者的预后相关，但是目前该基因如何促进肝癌及食管癌发生发展的作用机制仍未明了。我室于2001年在国内首次克隆了癌基因p28^GANK，并通过大量的临床肝癌样本的免疫组化检测，确认其表达蛋白p28^GANK可能为目前已知的具有一定肝癌细胞特异性的癌蛋白。我组前期研究发现干扰肝癌细胞中p28^GANK的表达可明显抑制细胞的增殖并可在体内外诱发肿瘤细胞凋亡，p28^GANK直接结合NF-κB/RelA，加速NF-κB出核，抑制其转录活性。此外，大鼠2-AAF/PH模型诱导的肝卵圆细胞活化过程中伴随着p28^GANK的mRNA和蛋白表达水平均上升、Rb磷酸化降解以及CDK4/CyclinD1的活化，提示p28^GANK可能在肝卵圆细胞介导的肝再生及肝卵圆细胞的细胞周期中发挥着重要作用;我室新发现OV6可以做为肝癌前体细胞的标志物，并研究了Wnt/β-catenin信号通路在OV6阳性细胞亚群中的重要调节作用。我们观察到OV6阳性的肿瘤性肝前体细胞中p28^GANK的mRNA表达升高，而Rb和p53蛋白表达下降，这些都提示p28^GANK可能与正常和肿瘤性肝前体细胞的活化存在某种联系。肿瘤相关蛋白调控肿瘤前体细胞的增殖和分化可能是肿瘤干细胞调控的机制之一，但是目前尚未见到癌蛋白p28^GANK调控肝癌前体细胞的相关报道，因此，探讨癌蛋白p28^GANK调控肝癌前体细胞活化的分子机制是本课题研究的重点，旨在加深我们对肿瘤生物学的认识，为研发新的肿瘤治疗药物和方法提供理论依据。实验方法：1.载体及病毒构建：构建过表达p28^GANK慢/腺病毒载体、由RNAi介导的低表达p28^GANK的慢/腺病毒载体及对照慢/腺病毒载体，在293T/293A细胞系中进行病毒包装、扩增以及滴度测定。2.建立稳定细胞系：构建过表达及RNAi引起低表达p28^GANK的SMMC-7721、HCC-LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞系。3.免疫磁珠分选：以OV6、CD133等作为肝癌前体细胞标志物，磁珠分选出肝癌前体细胞，比较p28^GANK在肝癌前体细胞以及非肝癌前体细胞中的表达差异，比较在过表达及低表达p28^GANK引起的肝癌前体细胞中其他干细胞相关基因的变化。4.流式检测：（1）流式双标OV6、CD133、EpCAM等干细胞表面标志物检测过表达及低表达p28^GANK的SMMC-7721、HCC-LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞系表面标志物差异。（2）将过表达及低表达p28^GANK的稳定肝癌细胞磁珠分选出肝癌前体细胞，7天后行流式检测其干细胞比率，检测p28^GANK对干细胞分化能力的影响。（3） spheroid克隆形成实验：将过表达及低表达p28^GANK的SMMC-7721、HCC-LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞以3000/孔接种低粘附板，检测p28^GANK对干细胞自我更新能力的影响。5.耐药实验：检测阿霉素、顺铂、5-FU、丝裂霉素等化疗药物对过表达及低表达p28^GANK的稳定肝癌细胞系在细胞增殖、克隆形成、干细胞比率、干细胞相关基因表达变化等方面的影响。6. NOD/SCID鼠皮下荷瘤实验：磁珠分选出SMMC-7721细胞中OV6阳性的肝癌前体细胞，分别感染过表达p28^GANK以及由RNAi介导的低表达p28^GANK的慢病毒以及相应的对照病毒，行NOD/SCID鼠皮下荷瘤，统计肿瘤发生率、瘤体体积、肺转移灶数目、并行皮下瘤组化检测相应分子变化。7.资料收集及统计方法：（1）随机选取2001.9²006.10年在我院行肝癌根治术的原发性肝细胞癌患者标本130例，制作组织芯片，并收集完善病史及随访资料;以免疫组化方法检测组织芯片标本中p28^GANK、OV6的表达，并统计分析p28^GANK、OV6的表达与肝癌患者各项临床特征（肿瘤大小、血管侵犯、肝内播散和远处转移等）及远期生存（无瘤生存率、总生存率和生存时间等）的关系。（2）将45例肝癌手术病人的原代细胞接种于低粘附板，收集7-10天后形成的spheroid，行real-time PCR,检测相应干细胞标志物变化。（3）用SAS9.1.3软件进行统计分析。结果以median （Q1-Q3）表示。χ2检验或Fisher确切概率法用来进行定性资料的比较。组间定量分析用wilcoxon配对秩检验。相关性分析采用spearman秩相关。累计生存和复发率的计算采用Kaplan-Meier，生存曲线用Log-rank绘制并进行生存分析。P<0.05视为统计显著。8.机制探索：（1）利用腺病毒在一系列肝癌细胞系中过表达或干扰p28^GANK，检测核转录因子Oct4（POU5F1）的表达情况；NOD/SCID鼠皮下瘤组化检测Oct4表达变化；在134例肝癌样本中利用western blot方法检测p28^GANK和Oct4的蛋白表达情况，并利用Quantity One软件进行半定量分析，统计两者表达的相关性；以免疫组化方法检测上述130例肝癌病人组织芯片标本中p28^GANK、Oct4的表达，统计两者相关性，并统计分析p28^GANK高表达病人中Oct4的高、低表达对远期生存（无瘤生存率、总生存率）的影响。（2）在293T细胞中转染Myc-p28^GANK、Flag-Oct4和HA-WWP2质粒，western blot检测Oct4的表达情况以及p28^GANK对Oct4泛素化程度的影响、免疫共沉淀检测上述分子有无相互作用并在SMMC-7721肝癌细胞系中验证p28^GANK和内源性WWP2的相互作用。（3）在293T细胞中转染一系列p28^GANK缺失突变体和HA-WWP2质粒，寻找p28^GANK和WWP2的相互结合位点。（4）在低表达以及正常表达p28^GANK的OV6阳性的SMMC-7721肝癌前体细胞中转染PCDNA3.1-Oct4及对照质粒行spheroid克隆形成实验，验证p28^GANK通过Oct4对肝癌前体细胞发挥调控作用。实验结果:1.在130例肝癌病人组织芯片标本中p28^GANK、OV6的表达呈正相关（r=0.2483, P=0.0044）, p28^GANK高表达的病人中OV6阳性的比率更高；p28^GANK、OV6双阳性的病人预后（无瘤生存率、总生存率）较差。2. p28^GANK在以OV6阳性/CD133阳性的肝癌前体细胞以及具有自我更新能力的spheroid中呈现高表达；在肝癌病人原代细胞形成的spheroid中，p28^GANK与干细胞相关基因CD133、EpCAM的表达呈正相关（分别为r=0.52, P=0.03以及r=0.49, P=0.0006）。3. p28^GANK的过表达可提高肝癌前体细胞的干细胞特性，包括前体细胞标志物以及干细胞相关基因的表达、肝癌细胞系中OV6、CD133以及EpCAM等干细胞标志物的比率、自我更新能力、延迟干细胞分化能力、以及对化疗药物的耐药性、NOD/SCID鼠体内成瘤性以及肺转移能力。4. LV-mip28^GANK2#具有更好的p28^GANK干扰效果，干扰p28^GANK的表达可减弱上述肝癌前体细胞的干细胞特性。5. p28^GANK对肝癌前体细胞的调控作用主要是提高前体细胞的增殖能力；p28^GANK在前体细胞中的抗凋亡作用不明显。6. p28^GANK可在蛋白水平上调Oct4的表达；western blot显示在134例肝癌样本中p28^GANK和Oct4的表达呈正相关（r=0.4939, P <0.0001）；在130例肝癌病人组织芯片标本中p28^GANK、Oct4的表达呈正相关（r=0.5217, P <0.0001）,p28^GANK高表达的病人（n=41）中Oct4的高表达使病人预后（无瘤生存率、总生存率）更差。7.在293T细胞中转染Myc-p28^GANK质粒可逆转HA-WWP2对Flag-Oct4的降解作用，提高Oct4的表达；免疫共沉淀检测发现p28^GANK可减弱WWP2和Oct4之间的相互作用以及WWP2对Oct4的泛素化降解；内外源性实验证实p28^GANK和WWP2之间存在相互结合作用；p28^GANK的C端以及N端可能是与WWP2相互结合的位点；p28^GANK与Oct4之间无相互结合作用。8.在低表达p28^GANK的肝癌前体细胞中过表达Oct4可减弱由于干扰p28^GANK造成的对肝癌前体细胞自我更新能力的下降。9. AKT信号通路以及Wnt/β-catenin信号通路可能部分参与了p28^GANK对肝癌前体细胞的正性调控；p53与Rb的状态不影响p28^GANK对肝癌前体细胞的调控。结论:本研究从病人样本、细胞水平以及动物体内水平证明p28^GANK对肝癌前体细胞存在正性调控作用。p28^GANK通过与E3泛素连接酶WWP2结合，阻碍了WWP2与Oct4的结合以及对后者的泛素化降解，在蛋白水平上调Oct4的表达，从而提高肝癌前体细胞的干细胞特性，包括前体细胞标志物以及干细胞相关基因的表达、肝癌细胞系中OV6、CD133以及EpCAM等干细胞标志物的比率、自我更新能力、延迟干细胞分化能力、以及对化疗药物的耐药性、NOD/SCID鼠体内成瘤性以及肺转移能力。干扰p28^GANK的表达可抑制肝癌前体细胞的干细胞特性，从而减缓肝细胞癌的进展过程。