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目的:本研究通过定量评估骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者外周血中性粒细胞的趋化、吞噬和释放活性氧(reactive oxygen specoes,ROS)的功能,以及上述功能相关基因在不同阶段的造血干/祖细胞层面的聚类,探索MDS患者中性粒细胞功能相关异常在造血干/祖细胞层面的源头。同时,本研究通过检测MDS患者各个阶段造血干/祖细胞的变化以及在单细胞扩增及分化培养体系中不同阶段的造血干/祖细胞的扩增及分化的能力,为理解MDS患者造血干/祖细胞本身粒系造血的分化异常,以及进一步认识并治疗由此产生的相关并发症提供理论依据。方法:利用TAXIScan-FL细胞动态分析系统检测中性粒细胞的趋化功能。利用双转盘激光共聚焦显微镜观察中性粒细胞吞噬酵母聚糖颗粒的吞噬百分率和吞噬效率。利用鲁米诺化学发光法监测中性粒细胞形成活性氧的动态过程。应用Gene Ontology(GO)数据库中与中性粒细胞趋化、吞噬和释放活性氧功能相关注释涉及的基因分析其在MDS造血干/祖细胞中的表达规律。利用FACS Aria Ⅲ流式细胞分选仪分选不同阶段的单个造血干/祖细胞在干细胞因子(stem cell factor,SCF)20ng/ml、FMS 相关酪氨酸激酶 3 配体(FMS-related tyrosine kinase 3-ligand,Flt3-L)20ng/ml、白细胞介素-3(interleukin-3,IL-3)20ng/ml、促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)50ng/ml 伴/不伴有粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)100ng/ml的培养体系培养,通过克隆大小和细胞形态学分析评估各个阶段造血干/祖细胞向中性粒细胞系扩增及分化的能力。结果:MDS患者外周血中性粒细胞绝对数为(2.25±1.53)x109/L,低于正常(P<0.001)。MDS患者中性粒细胞的趋化速度低于正常(13.60μm/minvs.26.40μm/min,P<0.001),趋化运动的方向性(0.55 vs.0.85,P<0.01)和向上迁移指数(0.70 vs.1.30,P<0.01)也远低于正常。MDS患者的中性粒细胞吞噬百分率低(24.50%vs.79.50%,P<0.05),中性粒细胞不能有效地吞噬病原体且存在细胞内及细胞外ROS的生成障碍(P<0.05)。MDS患者CD34+细胞中Lin-CD34+CD38-CD90-CD45RA-CD49f 的造血多能祖细胞(hematopoietic multipotent progenitor,MPP)亚群的比例中位数高于正常对照(4.60%vs.0.97%,P<0.05),Lin-CD34+CD38+CD135+CD45RA-的髓系祖细胞(common myeloid progenitor,CMP)占CD34+细胞的比例中位数在对照组、MDS低危组、MDS中危组和MDS高危组分别为42.90%、17.90%、8.75%和1.14%,MDS高危组中的CMP明显减少(P<0.05)。同时 Lin-CD34+CD38+CD135+CD45RA+的粒-单核系祖细胞(granulocyte-monocyte progenitor,GMP)占 CD34+细胞的 比例 中位数在对照组、MDS 低危组、MDS中危组和MDS高危组中逐渐降低,MDS中危组中GMP的比例就已明显低于对照组(P<0.01),高危组中更甚(P<0.001)。各阶段造血干/祖细胞在单细胞扩增培养条件下的细胞生长曲线呈现出不同的趋势,正常造血干/祖细胞在扩增或分化的培养条件下均表现为定向祖细胞CMP和GMP的生长速率高于多能祖细胞MPP,MPP又高于HSC的趋势。而MDS的造血干/祖细胞生长速率最高的是HSC,MPP的扩增效率低于HSC和定向祖细胞。对照组和MDS组的单个HSC扩增细胞数和克隆直径均无统计学差异,正常HSC分化至早幼粒细胞阶段时MDS组仅分化至原粒细胞阶段。MDS组的MPP形成的克隆大小与细胞扩增倍数均远低于对照(P<0.05),MDS组中MPP形成早中幼粒细胞时对照组已经分化至中幼粒细胞。MDS组的单个CMP扩增细胞数低于对照组(P<0.05)且CMP克隆小于对照组(P<0.05)。MDS组的单个GMP扩增细胞数低于对照组(P<0.05),单细胞培养2周后MDS组的GMP所形成的克隆直径亦明显小于对照(566μm vs.847μm,P<0.05)。与此同时,在G-CSF的作用下正常GMP扩增倍数可增高4倍,而MDS患者的GMP细胞对G-CSF的反应差,扩增效率无显著增高。MDS组中的CMP和GMP以及对照组的CMP单细胞培养2周后形成的细胞均类似中幼粒细胞,而对照组GMP已可分化为晚幼粒细胞。各种直接参与中性粒细胞功能的基因本体相关基因在GMP阶段可系统性地表达,参与中性粒细胞功能调控的基因本体的相关基因表达能够聚类70%以上的MDS患者,体现出MDS患者在GMP阶段细胞独特的粒系调控模式。结论:MDS患者造血干/祖细胞扩增能力的异常始于MPP阶段,MDS骨髓粒系造血的过程也堵塞于MPP阶段。MDS患者中性粒细胞数量的缺乏是其造血细胞自MPP阶段就出现扩增及分化能力减低所致。MDS患者中性粒细胞系的功能调控异常在GMP阶段即有集中体现,最终MDS患者中性粒细胞趋化、吞噬及产生ROS等多种功能的异常在外周血中得到显著体现。