【摘 要】
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毕赤酵母系统作为一种较为成熟的蛋白表达系统,不仅具有操作简单、生长速度快等特点,还具有真核细胞的翻译后修饰加工系统,且对营养要求低,可采用廉价的培养基,并适合于高密度发酵,被广泛应用于重组蛋白表达。利用核糖体rDNA整合是一种快速高效的多拷贝菌株构建的方法,在目的基因两端连上来自毕赤酵母rDNA中的非必需高度重复的基因片段,非转录间隔区（NTS）,基于抗性胁迫及筛选可以快速获得一系列不同拷贝数的菌
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毕赤酵母系统作为一种较为成熟的蛋白表达系统,不仅具有操作简单、生长速度快等特点,还具有真核细胞的翻译后修饰加工系统,且对营养要求低,可采用廉价的培养基,并适合于高密度发酵,被广泛应用于重组蛋白表达。利用核糖体rDNA整合是一种快速高效的多拷贝菌株构建的方法,在目的基因两端连上来自毕赤酵母rDNA中的非必需高度重复的基因片段,非转录间隔区（NTS）,基于抗性胁迫及筛选可以快速获得一系列不同拷贝数的菌株。此外,基于液体介质中转化后载体扩增的培养方法（液体PTVA）将重组菌株在液体培养基中培养,利用抗生素压力对不同拷贝数的菌株进行选择,结合微流控微生物培养适应性进化体系,及流式细胞分选技术对荧光标记的高产重组外源蛋白表达菌株的筛选,为进一步的高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株快速筛选方法构建提供了重要基础。主要研究内容及结果如下。（1）将EGFP与内质网转膜蛋白Sec63在毕赤酵母中融合表达构建GS115-E菌株,实验确证其对细胞生长及产生重组蛋白不产生影响。在GS115-E菌株中表达植酸酶与木聚糖酶,摇瓶培养分析不同荧光值与植酸酶及木聚糖酶表达量的相关性,结果显示内质网转膜蛋白Sec63融合表达的EGFP的表达水平与植酸酶重组蛋白的表达水平之间具有普遍且良好的线性相关性（0.8<|R|<1）。进一步利用流式细胞仪从构建的植酸酶不同表达水平的混合菌群中,筛选出低荧光与高荧光的细胞群,摇瓶培养120 h时后者植酸酶表达水平是前者的4.09倍。通过分析酵母细胞的EGFP荧光值代替检测重组蛋白的表达量与活性大大提高便捷性及通用性,为高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株提供了一种快速的筛选方法。（2）在构建了高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株快速筛选方法的基础上,利用非转录基因间隔区内目的基因的插入方法,基于液滴微流控技术使用液体PTVA适应性进化培养方法,以及流式细胞分选技术进行高效表达菌株的构建及筛选。在MMC体系培养液滴中逐步提升抗生素zeocin,使得构建的GS115-E/phy/NTS菌株进行适应性进化,分别在zeocin的浓度为100μg/m L的进化液滴中,筛选得到植酸酶重组表达水平为进化前3倍或以上的菌株共9株（其中分选后直接摇瓶培养,最终挑选的6株菌株里有4株菌株酶活表达为进化前菌株的3倍或以上,最高为3.80倍;先96孔板培养再摇瓶培养,最终挑选的6株菌株里有5株菌株酶活表达为进化前3倍或以上,最高为3.95倍）;在zeocin的浓度为200μg/m L时,筛选得到5株菌株植酸酶表达水平为进化前3倍或以上,最高为进化前的4.33倍;zeocin的浓度为300μg/m L时,筛选得到过60%挑选的高荧光菌株的酶活表达量为进化前3倍或以上,植酸酶表达水平最高达到进化前的3.50倍。初步建立了高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株构建及快速筛选方法。
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