论文部分内容阅读
【目的】观察人脐带间充质干细胞移植对大鼠烧伤治疗作用,并探求其机制。【方法】(1)分离纯化人脐带间充质干细胞(UC-MSCs),选用180~220g雄性SD大鼠,随机分为烧伤后对照组及烧伤后UC-MSCs移植治疗组,复合麻醉剂腹腔注射麻醉后制备大鼠烧伤模型;观察两组大鼠烧伤后的创面愈合情况及其愈合率,同时用HE染色观察大鼠烧伤局部皮肤组织的病理结构,比较UC-MSCs的治疗效果。(2)分别收集烧伤后12h、1天、3天、7天的治疗组及对照组大鼠损伤局部的皮肤组织,抽提蛋白,ELISA检测治疗组及对照组大鼠皮损内TNF-α、IL-1及IFN-γ的表达;免疫印迹检测MCP-1及CCX-2的表达;免疫组化检测皮损中成纤维细胞及新生血管的数量。(3)培养骨髓(BM) -MSCs,传代后分别用含有体积分数为10%正常人血清、烧伤患者血清的低糖达氏修正依氏培养基培养,用噻唑蓝(MTT)法测定其生长曲线,碘化丙啶(PI)染色,流式细胞术分析细胞周期、β-半乳糖苷酶(β-gal)染色测定MSCs的衰老情况。【结果】(1)采用贴壁法培养UC-MSCs,细胞呈成纤维样的细胞形态,细胞之间相互连接,表现为成纤维状细胞特有的形态。分离得到的细胞其表面标记CD105、CD73、CD90表达阳性率大于95%;CD34、CD45、CD14、CD79、HLA-DR表达阳性率小于2%。体外诱导分化发现第7天细胞胞质内有高折光性的小脂滴出现,主要集中于细胞核周围,随着诱导时间的延长细胞内脂滴逐渐增多,MSCs向脂肪细胞分化后PPARγ2、LPL的mRNA表达阳性。第5天在倒置显微镜下可观察到细胞形成广泛均一的钙化结节样结构,Runx2/CBFA1、Osteocalcin的mRNA表达阳性。成年大鼠烧伤后,创面轻度肿胀,创面为黄白色,无水泡形成,活动自如,反应较敏捷。烧伤后第二天,创面颜色变深,创面出现散在的红色斑块,形状不规则。第三天时创面呈现灰白色,并出现痂皮,触之较硬。统计各组的愈合时间,发现UC-MSCs移植治疗组大鼠创面愈合时间为22±3.1天,对照组则为27±3.1天。切痂术后14天开始,UC-MSCs移植治疗组的愈合率(56.3%)与对照组(47.2%)相比较存在明显差异,移植治疗组大鼠创面的愈合率较对照组显著加快。对大鼠皮肤行HE染色,观察其变化,发现:烧伤后表皮与真皮均受损伤,表皮细胞部分脱落,结构不清,表皮下可见组织水肿,血管扩张充血。表皮层与真皮层两层分界不清,真皮层胶原肿胀,表现为均质化,有脱水样改变。部分皮肤出现汗腺、皮脂腺及毛囊破坏。切痂术后14天,各组创面均出现肉芽组织,治疗组的肉芽组织较为丰富,毛细血管及成纤维细胞的数量显著增多,并有大量的红色胶原纤维,排列有序;对照组的新生肉芽组织增生较少,其毛细血管及成纤维细胞数量较移植治疗组显著减少;切痂术后21天,各组创面均可见表皮层有较多的坏死细胞及新生的肉芽组织,毛细血管数量增多,胶原含量丰富。其中移植治疗组创面中各层次的结构较对照组清晰,且新生的成纤维细胞数量较对照组显著增加。切痂术后28天,移植治疗组的皮肤各层结构清晰,有新生的毛细血管,而对照组皮肤虽有形成,但是层次模糊,且新生血管中有较多的充血。(2)分别收集烧伤后12h、1天、3天、7天治疗组及对照组大鼠损伤局部的皮肤组织,抽提蛋白,ELISA检测治疗组及对照组大鼠皮损内上述细胞因子的表达情况。结果发现在损伤大鼠的皮肤组织内,随着损伤时间的延长,皮损内细胞因子TNF-α、IL-1逐渐增加,烧伤后3天达到高峰。而给予UC-MSCs移植治疗后,烧伤后7天,治疗组内上述两种细胞因子的表达显著下降;同时我们也检测了大鼠烧伤后皮损内IFN-γ的表达,发现具有抑制炎症反应作用的IFN-γ在烧伤后3天最低,给予UC-MSCs移植后,治疗组中IFN-γ的含量显著增加;检测参与淋巴细胞浸润诱导的两种趋化因子MCP-1及CCX-2的变化,发现烧伤后7天,受损皮肤中MCP-1及CCX-2的表达治疗组较对照组显著降低。UC-MSCs移植后比较对照组及治疗组烧伤7天时受损皮肤中MCP-1及CCX-2的表达量,发现UC-MSCs能抑制上述两种趋化因子的表达。免疫组化分析发现,在UC-MSCs移植治疗组中,新生的成纤维细胞数量在烧伤切痂后14天时较对照组显著增加;在大鼠烧伤切痂后14天,大量的新生血管开始出现,治疗组与对照组相比,UC-MSCs移植治疗能促进血管的形成及成纤维细胞的增殖。(3)烧伤患者血清组培养MSCs较正常人血清组培养生长速度加快,烧伤患者血清组细胞中G0/G1期细胞比例明显低于正常人血清组,β-gal染色阳性细胞数目显著低于正常人血清组。【结论】(1)人脐带间充质干细胞能有效促进深度烧伤创面的愈合;(2)人脐带间充质干细胞能通过抑制局部的炎症反应,促进血管的形成及成纤维细胞的增殖,参与损伤的修复;(3)烧伤患者血清内含有能促进BM-MSCs生长的物质。