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动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发病率及引发的严重临床心血管事件逐年上升。AS的发病机制涉及到免疫炎症,脂代谢紊乱,氧化应激,血管内皮损伤及血流动力学的改变等,是一个极其复杂的病理过程。尽管关于AS的病理生理学研究已较为深入,但炎症反应瀑布和脂质代谢失调为主的恶性循环的确切机制尚不明确,寻找针对AS多靶点整合起效、毒副作用小的干预方法,是当今医学界关注的热点之一。 单核/巨噬细胞参与AS的发生发展,是动脉粥样斑块中的主要成分之一。在内、外源性的致炎介质的刺激下,血管内皮细胞受损,释放出多种细胞因子和趋化因子,吸引单核细胞粘附并穿透至血管内膜下,分化为巨噬细胞(Macrophages)。巨噬细胞功能性的吞噬脂质后成为泡沫细胞(Foam cell),泡沫细胞的坏死、凋亡、焦亡和脂质沉积便成为早期粥样斑块的脂质核心。其中,各种危险因素刺激和脂质代谢过程所引起的免疫炎症反应瀑布,在AS的发生和发展过程中起到了至关重要的作用, AS病程中起重要推动作用的NLRP3炎症小体活化、炎症信号通路(NF-κB、MAPK等)激活及多种炎症因子(如IL-6、IL-1β、TNF-α等)释放,加剧了泡沫细胞沉积,平滑肌细胞与基质胶原增殖和纤维组织形成,这一系列病理过程不断促进粥样斑块扩大、血管内中膜变形和管腔狭窄。同时,上述病程中产生的坏死因子及残余物质的清除减少,活性氧(ROS)簇激增,线粒体的损伤及溶酶体酶的释放,又反馈式的刺激脂代谢异常和炎症反应的持续进行,形成恶性循环,使AS病变不断发展。值得注意的是,细胞的自噬对代谢异常和炎症反应的坏死物质有自身清除的作用,在动脉粥样硬化中,基础水平的自噬可有效的保护细胞及组织的功能,已成为动脉粥样硬化等颗粒性物质所致的免疫炎症性疾病研究的新靶点。 小分子GTP酶Rac是Rho GTP酶超家族成员之一,有高度同源的Rac1、Rac2、Rac3三种亚型,对细胞骨架重构、氧化应激、细胞间粘附、吞噬和致炎物质释放等多项细胞功能有重要的调节作用。Rac家族亚型通过结合GTP酶而具活性,因结合GDP而失活,彼此循环发挥着细胞信息传导的“开关作用”。近年来的研究发现Rac1在高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病中的重要作用,已作为心脑血管疾病基础研究中的重要干预靶点。相关研究显示,Rac1参与刺激血小板源生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎症因子的活化。Onkawara等发现在Ox-LDL所诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)中,Rac1参与VSMCs的增殖和炎症反应。Rac1参与内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表达及激活的调节,从而影响血管壁内皮细胞的损伤以及氧自由基的增多,这一重要作用导致内皮细胞还原型辅酶改变进而影响血压的变化。另外,有研究证实在糖尿病患者中,Rac1与氧化氮代谢产物(Nitric oxide metabolite,NOX)的相互作用是影响血糖高低的一个关键因素。Akbar等研究表明Rac1作为一个关键分子参与肌动蛋白重组,板状伪足形成的起始,剪应力刺激后血小板聚集、粘附、收缩和释放,说明Rac1是血小板释放过程的必要途径。目前还有研究认为,Rac1有潜力作为急性冠脉综合症的防治靶标。另外,体外实验证明Rac1可提高盐皮质激素受体的活性,从而参与盐皮质激素受体通路中调节高血压的机制。上述诸多研究表明,Rac家族中Rac1心脑血管疾病中的关键调控作用。但是,关于Rac家族其他两种亚型Rac2、Rac3在动脉粥样硬化等心血管研究领域作用的研究甚少。 鉴于Rac2、Rac3与Rac1在蛋白质一级结构上的高度同源及局部的差异,可能发挥与Rac1在调节细胞功能方面相似但又存在特异性的作用。因此,本课题旨在探讨小GTP酶Rac1、Rac2、Rac3三种亚型在动脉粥样硬化体外细胞模型THP-1单核/巨噬细胞中对泡沫细胞形成过程中多个环节、氧化应激反应、NLRP3炎症小体及炎症通路的活化分别有着何种作用及其机制。由于Rac家族亚型对细胞骨架蛋白和生长发育至关重要,所以目前尚无针对Rac2、Rac3的特异性抑制剂。为了明确Rac三种亚型独立发挥的作用,本实验中采用了目前已有的三种Rac亚型相关的小分子抑制剂,同时结合Indusible shRNA分别干扰THP-1细胞中Rac各亚型的表达进而分别抑制Rac1、Rac2、Rac3的活性,详细阐述Rac家族各亚型对脂质代谢和炎性反应的不同调节作用。为寻找对动脉粥样硬化有重要调节作用的潜在干预靶点提供新的手段和思路,为临床药物的开发提供了新方向。 目的:探索Rac1、Rac2、Rac3三种亚型在THP-1单核/巨噬细胞AS模型中对脂质代谢和炎症反应的不同作用及分子机制。 方法:采用了三种Rac亚型相关的抑制剂NSC23766(Rac1特异性抑制剂)、EHOP016(Rac1、3特异性抑制剂)、EHT1864(Rac1、2、3抑制剂),同时结合IndusibleshRNA分别抑制Rac1、Rac2、Rac3的活性,比较三种亚型的不同作用。首先,使用Ox-LDL刺激THP-1单核/巨噬细胞,建立荷脂、粘附、迁移和趋化等AS细胞模型,通过油红O染色、细胞免疫荧光、划痕实验、Transwell小室、Western blot等手段,观察Rac家族三种亚型对THP-1单核/巨噬细胞泡沫化过程中多个环节的不同作用;其次,通过Ox-LDL刺激THP-1单核/巨噬细胞发生氧化应激反应,采用ROS荧光探针、JC-1荧光探针、流式细胞仪、Western blot、扫描电镜等手段,研究Rac各亚型对动脉粥样硬化中氧化应激反应ROS生成、线粒体膜电位和结构改变、及细胞自噬的不同作用。最后,我们用Western blotting、Rea1-time PCR、ELISA的方法观察Rac各亚型对NLRP3炎症小体活化和NF-κB信号通路的不同作用。 结果: (1)抑制Rac2对THP-1单核/巨噬细胞中脂质摄取、LOX-1表达、细胞粘附和趋化都有十分显著的抑制作用,且其作用明显强于Rac1,而Rac3对上述细胞功能无明显调控作用。 (2)抑制Rac2对ROS生成、线粒体膜电位减低及其结构的损伤有明显的抑制作用,抑制Rac1对上述细胞功能的抑制作用次之; Rac3对上述细胞功能无明显作用,但抑制Rac3对THP-1单核/巨噬细胞自噬的产生有明显的上调作用。 (3)抑制Rac2对NLRP3炎症小体的活化及NF-κB信号通路的激活都有显著的抑制作用,且其作用强于Rac1,而Rac3并无明显调控作用。 结论: Rac家族三个亚型中,Rac2对THP-1单核/巨噬细胞泡沫化、氧化应激及NLRP3介导的免疫炎症反应的调控作用最明显,Rac1次之,而Rac3无明显作用。