目的:炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease,IBD)是一类病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病。最近研究发现中性粒细胞在某些特殊刺激因子作用下能够形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophilextracellulartraps,NETs)的胞外网状结构,在机体抗感染中发挥重要作用,通过黏附固定的方式限制病原微生物的蔓延,随后其自身分泌的免疫效应分子杀灭病原,与此同时NETs可降解部分免疫效应分子以限制炎症反应。但NETs若生成过多或未及时降解也可以促进炎症风暴,造成正常细胞和组织的损伤。对于IBD患者,NETs形成时间、变化规律及其与肠道黏膜损伤的作用关系尚未见报道。本研究以此为基础,研究NETs在IBD疾病模型中的表达特点,明确NETs相关组分对疾病活动程度有无关联,初步探讨NETs与肠上皮屏障功能损伤之间的关系,并以此为靶点为研制新型的维持和修复肠黏膜屏障的有效药物奠定理论与实验基础。研究方法:1、收集临床病例:收集自2017年3月至2018年9月在中国医科大学附属盛京医院小儿消化内科治疗的溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)(n=17)以及克罗恩病(Crohndisease,CD)(n=29)患者血液标本,选取同一时期发育儿科健康体检儿童8例作为空白对照组。采用荧光酶标仪检测血清游离DNA(cf-DNA)水平。2、动物实验:(1)选取6-8周龄的BALB/c小鼠共48只,随机均分为对照组和DSS组,每组依据给药后不同观察时间又均分为Day1、Day3、Day5组。DSS组小鼠自由饮用含3%葡聚糖硫酸钠(Dextransulfatesodiumsalt,DSS)的蒸馏水共7天,Ctrl组饮用蒸馏水。在模型建立后不同时间点(第1、3、5天)留取两组小鼠外周血及结肠组织。(2)选取6-8周龄的BALB/c小鼠共26只,随机分为Ctrl组(n=8)、DSS组(n=10)和DNaseI组(n=8);Ctrl组饮用蒸馏水7天,DSS组与DNaseI组小鼠饮用含3%DSS蒸馏水共7天,DNaseI组在饮用DSS第1、3、5天皮下注射DNaseI(10mg/kg),DSS组皮下注射同体积PBS。在模型建立成功后留取各组小鼠外周血及结肠组织,部分标本多聚甲醛固定,用于制作石蜡切片;将准备做蛋白半定量检测的动物标本置于-80℃冰箱中保存。采用荧光酶标仪检测血清游离cf-DNA及组蛋白水平,应用Luminex多因子检测技术检测小鼠外周血TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17、IGF-1水平,应用免疫荧光染色方法观察结肠组织CitH3及MPO的表达及定位,应用免疫组化染色方法观察结肠紧密连接蛋白Claudin-1的表达,应用TUNEL染色观察结肠组织的细胞凋亡情况,应用WesternBlot方法检测结肠组织CitH3、Claudin-1及CleavedCaspase-3的表达情况。3、细胞实验:(1)PLB-985细胞经二甲基甲酰胺(Dimethylformamide,DMF)诱导分化为具有中性粒细胞特性的细胞,应用不同剂量佛波醇(Phorbolmyristateacetate,PMA)(0nM组、20nM组、50nM组、100nM组)刺激细胞生成NETs,分别在给药第0、30、60、120、180、240min收集细胞上清液,采用荧光酶标仪检测cf-DNA水平,选择最佳给药浓度及反应时间。(2)将已诱导分化的PLB-985(DifferentiationedPLB-985,d-PLB-985)细胞接种于孔板中,按如下顺序分组:对照组、PMA组、DNaseⅠ组、Cl-amidine组、PMA DNaseⅠ组、PMA Cl-amidine组。给药4h后一部分细胞与培养基一同收集(即NETs)进行下一步实验;收集细胞上清液检测cf-DNA水平;离心后的细胞分成两部分:一部分用于免疫荧光染色观察NETs生成情况,另一部分用于提取蛋白进行WesternBlot检测CitH3蛋白表达。(3)调整Caco-2细胞状态至对数生长期,按以下顺序分组:Ctrl组、PLB-985组、PMA组、NETs组、NETs DNaseⅠ组、PLB-985 DNaseⅠ组,4h后收集细胞,通过检测跨膜电阻率、FD-4透过率观察细胞通透性,通过划痕实验与Transwell实验观察细胞迁移能力,应用免疫荧光染色及WesternBlot方法检测Claudin-1蛋白的表达。(4)调整Caco-2细胞状态至对数生长期,按以下顺序分组:Ctrl组、NETs组、NETs IGF-1组、IGF-1组,4h后收集细胞,检测指标同细胞实验(3),应用WesternBlot方法检测Claudin-1、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达变化。结果:1、IBD组患者血清cf-DNA水平明显高于健康对照组(P