第一部分天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型VEGF、CD34的影响目的:探讨天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型成活保护机制作用,以及对皮瓣血管内皮细胞生长因子(VEGF)、CD34的作用是否相同。方法:1、动物模型建立:Wistar大鼠30只,雌雄不限。大鼠麻醉后,取俯卧位固定于手术台,以8%硫化钠涂于大鼠背部术区进行脱毛,温水清洗脱毛区后用画线笔设计以后正中线为轴,蒂在尾端(以骼棘连线为底)的10cm×3cm的背部超长随意皮瓣。消毒术区,铺无菌手术巾,严格无菌操作。沿设计线切开至背部肌膜,在其浅面将皮肤与肉膜由头端向尾端剥离,保证所形成皮瓣为随意皮瓣,在皮瓣形成后即刻3-0丝线缝合。根据术后注射药物不同,皮瓣随机分为3组(n=30),每组10只。A组在皮下注射5u天然水蛭素; B组皮下注射5u重组水蛭素;C组皮下注射相同剂量生理盐水。每组皮瓣注射部位均为在距皮瓣末端约1.5cm和3cm处,分术后即刻、第3、5天注射达皮下层次。2、术后对大鼠背部皮瓣进行连续的临床观察并记录。观察实验动物是否出现腹泻,弓背,翘毛,精神萎靡及皮肤溃疡等免疫排斥反应。观察皮瓣颜色、厚度、弹性、渗出、毛发生长、坏死范围及针刺皮瓣出血情况,详细记录。3、术后第7天,在皮瓣远端约2～3 cm处切取0.5cm×0.5cm大小全层皮肤组织;组织浸泡于4%多聚甲醛液中。固定7天后石蜡包埋,制成4um厚的切片,HE染色。观察皮瓣组织的中性粒细胞浸润、细胞水肿、毛细血管增生、肉芽组织生成等情况。4、手术后的第3、5、7天分别在皮瓣远端2～3 cm处取约0.5cm×0.5 cm大小的全层组织,测定VEGF、CD34含量,以血管内皮细胞生长因子和CD34作为血管标记行免疫组化染色,计数皮瓣新生血管密度。荧光RT-PCR测定VEGFmRNA表达量。5、术后第7天,麻醉大鼠后,展平背部,用数码照相机拍摄皮瓣情况,用Image-Pro6.0软件分析系统计算皮瓣坏死面积、成活面积和总面积并计算皮瓣成活率。结果:1、皮瓣存活情况的大体观察三组大鼠均无死亡,皮瓣术后无感染。术后第7天,三组皮瓣远端不同面积痂壳形成,坏死区域稳定,成活与坏死界限较清楚,天然、重组水蛭素组皮瓣痂壳呈现深浅不一致灰色,浅灰色,部分痂壳较软,能轻易剥落,剥落后可见创面鲜红出血,对照组痂壳呈棕深黑,较硬,不易剥落,局部有溃烂。2、皮瓣组织学观察术后7天,天然水蛭素组皮瓣表皮完整,无萎缩,轻度角化过度,真皮内及皮下无明显炎症细胞浸润,组织无水肿,真皮下微血管多;重组水蛭素组表皮萎缩不明显,皮下组织轻度水肿,炎症细胞浸润略重,真皮下微血管较多;对照组皮下水肿明显,大量炎症细胞浸润,局部表皮溃疡形成,真皮下仅有少量微血管。3、VEGF染色阳性的各实验组血管密度值免疫组化着色好,染色效果好,背景干净无污染,阳性细胞显示明确。VEGF主要定位于细胞浆中,VEGF阳性表达的细胞被染成棕色颗粒。术后第3天,VEGF染色阳性血管数目:天然水蛭素组(A)为41.71±3.08,重组水蛭素组(B)为33.05±2.23,对照组(C)为14.71±2.67,各组两两比较P<0.05,其中A组VEGF染色阳性血管数最多,B组次之,C组最少。术后第5天,VEGF染色阳性血管数目:天然水蛭素组(A)为55.24±3.96,重组水蛭素组(B)为41.63±3.97,对照组(C)为8.63±2.59,各组两两比较P<0.05,其中A组VEGF染色阳性血管数最多,B组次之,C组最少。术后第7天,VEGF染色阳性血管数目:天然水蛭素组(A)为40.76±3.69,重组水蛭素组(B)为32.93±2.54,对照组(C)为3.58±2.97,各组两两比较P<0.05,其中A组VEGF染色阳性血管数最多,B组次之,C组最少。在A组,VEGF染色阳性血管数目在术后第5天与第3、7天相比P<0.05,高峰在术后第5天;在B组,VEGF染色阳性血管数目在术后第5天与第3、7天相比P<0.05,高峰在术后第5天;在C组,VEGF染色阳性血管数目在术后第3天与第5、7天两两相比P<0.05,高峰在术后第3天。4、CD34染色阳性的各实验组血管密度值CD34主要定位于细胞浆中,少量在细胞膜亦有表达,CD34阳性细胞表现为棕黄色至棕褐色颗粒。术后第3天,CD34染色阳性血管数目:天然水蛭素组(A)为56.83±3.19,重组水蛭素组(B)为47.12±2.13,对照组(C)为21.82±2.56,各组两两比较P<0.05,其中A组CD34染色阳性血管数最多,B组次之,C组最少。术后第5天,CD34染色阳性血管数目:天然水蛭素组(A)为70.13±3.85,重组水蛭素组(B)为52.74±3.08,对照组(C)为16.52±2.48,各组两两比较P<0.05,其中A组CD34染色阳性血管数最多,B组次之,C组最少。术后第7天,CD34染色阳性血管数目:天然水蛭素组(A)为55.87±3.75,重组水蛭素组(B)为45.93±3.65,对照组(C)为11.47±2.87,各组两两比较P<0.05,其中A组CD34染色阳性血管数最多,B组次之,C组最少。在A组,CD34染色阳性血管数目在术后第5天与第3、7天相比P<0.05,高峰在术后第5天;在B组,CD34染色阳性血管数目在术后第5天与第3、7天相比P<0.05,高峰在术后第5天;在C组,CD34染色阳性血管数目在术后第3天与第5、7天两两相比P<0.05,高峰在术后第3天。5、荧光RT-PCR检测各组皮瓣组织VEGFmRNA的表达电泳后各泳道均可见特异性条带,与DNA标记进行比较,产物大小与预期产物大小一致,分别为VEGF164 bp,GAPDH 152 bp。术后第3天, VEGFmRNA的表达:天然水蛭素组(A)为28.69±2.07,重组水蛭素组(B)为23.94±3.12,对照组(C)为19.64±1.92,各组两两比较P<0.05,其中A组VEGFmRNA的表达最多,B组次之,C组最少。术后第5天,VEGFmRNA的表达:天然水蛭素组(A)为33.13±4.07,重组水蛭素组(B)为29.52±2.89,对照组(C)为15.52±3.48,各组两两比较P<0.05,其中A组VEGFmRNA的表达最多,B组次之,C组最少。术后第7天,VEGFmRNA的表达:天然水蛭素组(A)为27.87±2.58,重组水蛭素组(B)为22.93±3.43,对照组(C)为10.47±2.86,各组两两比较P<0.05,其中A组VEGFmRNA的表达最多,B组次之,C组最少。在A组,VEGFmRNA的表达在术后第5天与第3、7天相比P<0.05,高峰在术后第5天;在B组,VEGFmRNA的表达在术后第5天与第3、7天相比P<0.05,高峰在术后第5天;在C组,VEGFmRNA的表达在术后第3天与第5、7天两两相比P<0.05,高峰在术后第3天。6、皮瓣存活表面积:皮瓣存活表面积:天然水蛭素组(A): 26.64±2.24(cm~2),重组水蛭素组(B): 23.64±2.02(cm~2),对照组(C): 20.71±1.41(cm~2);皮瓣存活率(%):天然水蛭素组(A): 88.87±2.24,重组水蛭素组(B): 79.97±2.02,对照组(C): 69.07±1.42.各组之间两两比较,P<0.05。结论:天然、重组水蛭素能够促进随意皮瓣VEGF、CD34表达,改善淤血皮瓣的微循环,有利于新生血管的生成,能够提高随意皮瓣的成活率,天然水蛭素效果优于重组水蛭素。第二部分天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型SOD、MDA、ET影响目的:探讨天然、重组水蛭素对大鼠随意皮瓣淤血模型存活保护机制作用,以及对皮瓣的丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、内皮素(ET)作用是否相同。方法:1、动物模型建立:同第一部分。2、术后对大鼠背部皮瓣进行连续的临床观察并记录。同第一部分。3、皮瓣组织学的观察,同第一部分。4、术后第7天测定皮瓣成活率,以及丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、内皮素(ET)含量;其中丙二醛(MDA)的检测采用硫代巴比妥酸法,超氧化物岐化酶(SOD)的检测采用羟胺法,内皮素(ET)的检测采用酶联免疫吸附试验法。结果:1、皮瓣存活情况的大体观察同第一部分。2、皮瓣组织学观察同第一部分3、术后第7天皮瓣组织丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、内皮素(ET)含量:皮瓣组织丙二醛(MDA)含量:天然水蛭素组(A):10.20±3.41(nmol/mgprot),重组水蛭素组(B):22.12±3.84(nmol/mgprot),对照组(C):32.65±3.91(nmol/mgprot);各组之间两两比较,P<0.05。术后第7天皮瓣组织超氧化物岐化酶(SOD)含量:天然水蛭素组(A):72.59±17.48(U/mgprot),重组水蛭素组(B):36.68±8.32 (U/mgprot),对照组(C):27.66±11.34(U/mgprot);各组之间两两比较,P<0.05。术后第7天皮瓣组织内皮素(ET)含量:天然水蛭素组(A):85.67±37.90,重组水蛭素组(B):163.55±43.45,对照组(C):247.56±38.04;各组之间两两比较,P<0.05。用药组(A组和B组)皮瓣成活率比对照组(C组)高,超氧化物岐化酶(SOD)用药组(A组和B组)比对照组(C组)明显增多,丙二醛(MDA)、内皮素(ET)含量则减少。4、皮瓣存活表面积:同第一部分。结论:水蛭素能够提高随意皮瓣的成活率、超氧化物岐化酶(SOD)的含量;减低皮瓣的坏死率、丙二醛(MDA)、内皮素(ET)的含量。实验组较对照组有明显差异。水蛭素具有抗血栓、抗凝、抗氧化和抗炎症作用。其中,天然水蛭素效果最明显,重组水蛭素次之。