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目的：DLC-1(deletedinlivercancer，DLC-1)基因，位于人类染色体8p21—p22，可能是一个新的抑癌基因。1998年Yuan等首先用代表性差异分析技术(representationaldifferenceanalysis，RDA)将DLC-1基因从原发性肝癌组织中分离出来，并认为该基因改变是肝癌的早期发生事件之一．随之，对DLC-1基因功能及其在乳腺癌、肺癌、胃癌和前列腺癌等恶性肿瘤中的发病机制的研究也陆续展开。迄今，已发现在肝癌和胃癌中DLC-1基因启动子区域高甲基化状态可导致DLC-1基因表达的沉默。在许多其它恶性肿瘤如肝癌、髓母细胞瘤、乳腺癌中的研究表明：DLC-1基因可抑制肿瘤细胞的增殖，DLC-1基因可能是一个新的抑癌基因。而目前，关于DLC-1基因在结直肠癌中研究的报道甚少。研究首先收集8例肠癌组织临床标本及相应的癌旁组织，检测DLC-1基因的表达水平，并研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。应用RNAi(RNAinterference)技术抑制结肠癌LoVo细胞株中DLC-1基因mRNA及蛋白的表达水平，采用脂质体法转染真核表达载体过表达HT-29细胞中DLC-1基因，观察DLC-1基因对肠癌细胞生物学方面的影响。
方法：1.RT-PCR技术检测8例结直肠癌及癌旁组织中DLC-1基因表达并比较差异。2.采用RT-PCR技术和Westernblot分别检测DLC-1基因在人肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平。3.应用甲基化特异性聚合酶链反应技术(methylationspecificPCR，MSP)检测人肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中DLC-1基因启动子区甲基化状态；亚硫酸氢盐修饰人肠癌细胞株HT-29和LoVoDNA后，测序检测DLC-1基因启动子区域甲基化状态。4.分别用0、5、10μmol/L浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态HT-29细胞，观察DLC-1基因表达水平的改变。5.构建DLC-1的RNAi重组体，转染表达阳性的肠癌LoVo细胞株，RT-PCR检测转染前后LoVo细胞的DLC-1mRNA表达水平，Westernblot蛋白印迹法检测DLC-1蛋白表达。6.采用重组的全长DLC-1基因cDNA真核表达载体转染表达阴性HT-29细胞，建立稳定转染细胞株RT-PCR和Westernblot检测细胞中DLC-1基因的表达。7.MTT比色法和克隆形成实验(平板克隆实验和软琼脂实验)观察细胞增殖状况；侵袭小室实验及迁移实验检测侵袭能力的改变；黏附实验检测细胞黏附能力的改变；流式细胞技术检测细胞周期。
结果：1.8例结直肠癌组织中2例DLC-1基因有表达，6例无表达，而6例相应的癌旁组织均阳性表达；人肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1mRNA及蛋白呈阳性表达，HT-29的表达呈阴性。2.甲基化检测结果显示CaCo-2和LoVo细胞株DDC-1基因非甲基化引物扩增出172bp大小的目的片段，而HT-29细胞株甲基化引物扩增出178bp目的条带。DLC-1基因启动子区扩增产物291bp，其测序结果与GeneBanJkAF035119第168位至220位核苷酸序列比对，其中LoVo细胞株7个CpG位点的C转变为T，显示未发生甲基化，而HT-29细胞株C未改变，显示CpG位点呈甲基化状态。结果表明：CaCo-2和LoVo细胞DLC—1基因启动子区域未发生甲基化，而HT-29出现启动子区高甲基化状态。3.经0、5、10μmol/L浓度5-氮杂胞苷药物干预3d后，10μmol/L浓度下5-氮杂胞苷处理HT-29肠癌细胞株的DLC-1基因表达得到恢复。4.成功构建发卡siRNA(smallinterfereRNA)真核表达载体pGCsiDLC；转染LoVo细胞后，DLC-1mRNA和蛋白表达水平明显下降，以siRNA转染48h后抑制作用最为明显。5.siRNA真核表达载体pGCsiDLC-1抑制DLC-1基因表达后，LoVo细胞增殖能力亦随时间的增加而逐渐增高，瞬时转染后以48h最为明显；平板克隆实验及软琼脂实验显示抑制DLC-1基因表达后LoVo细胞形成的克隆数量亦比脂质体组细胞数量增多(p<0.05)，克隆体积增大。侵袭实验证明干扰组LoVo细胞穿过人工构建基底膜的数目明显多于脂质体组(p<0.05)，提示细胞侵袭能力明显增强；抑制DLC-1基因表达后LoVo细胞黏附能力亦显著增强(p<0.05)；抑制DLC-1基因表达前后LoVo细胞迁移能力未见明显变化。6.脂质体法转染真核表达pcDNA3.1-DLC-1的重组质粒至HT-29细胞后，DLC-1基因mRNA和蛋白水平均呈阳性表达，转染组增殖能力明显低于空白载体组，与空白载体组相比其克隆形成的数目减少(p<0.05)，克隆体积减小；转染组G2期细胞数量分布减少(p<0.05)。
结论：1.结直肠癌组织中DLC-1基因表达阴性，而相对应的癌旁组织表达阳性，CaCo-2和LoVo细胞株DLC-1基因表达阳性，而HT-29细胞株DLC-1基因表达阴性，DLC-1基因在三种人结肠癌细胞株中表达各异。提示DLC-1基因可能与肠癌的发生发展存在相关性。2.CaCo-2和LoVo细胞株DLC-1基因表达阳性，其DLC-1基因启动子区域未检测到甲基化，而表达DLC-1基因阴性的HT-29细胞株，却呈现启动子区高甲基化状态。5-氮杂胞苷处理HT-29结肠癌细胞使之去甲基化后，可使DLC-1基因恢复表达，进一步证实启动子区高甲基化状态导致DLC-1基因表达沉默。提示HT-29结直肠癌细胞株DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。3.DLC-1基因靶向RNA干扰重组质粒可有效抑制LoVo细胞中DLC-1基因的表达，并可抑制LoVo细胞的增殖，降低肿瘤细胞的侵袭和黏附能力。提示DLC-1基因与结肠癌LoVo细胞株生物学行为相关。4.过表达DLC-1基因可抑制HT-29细胞的增殖，并使细胞周期重新分布。
研究结果提示：DLC-1是一个潜在的抑癌基因，并在结肠癌发病机制中起重要作用。其在结肠癌中的表达缺失，与该基因启动子区高甲基化有关。