背景与目的:糖尿病肾病(DiabeticNephropathy,DN)是一种发病率较高的糖尿病并发症之一,其很容易导致此类患者的死亡。关于DN发病机理的研究已经有很多,一些学者发现足细胞损伤在糖尿病肾病发病的过程中发挥了重要作用。炎症反应、氧化应激、RAAS系统的激活等因素均参与了足细胞损伤的发生。因此,探索糖尿病肾病中促进足细胞损伤的相关机制,以期获得更佳的治疗策略,是当前的研究热点。火把花,又名昆明山海棠(THH),成分复杂,有效成分为火把花根总生物碱(THHta),动物试验和临床研究均显示THHta对糖尿病肾病蛋白尿疗效明显。课题组前期实验也证明THHta能够明显减轻高糖诱导的足细胞损伤,但其分子机制还未明确。本研究旨在探讨THHta如何从基因层面、蛋白水平减轻足细胞损伤,延缓糖尿病肾病的可能机制。研究方法:(1)高糖诱导足细胞损伤模型建立。体外培养条件永生性小鼠足细胞,将全部小鼠随机分为5组:正常对照组(5.5mmol/L glucose),不同剂量高糖组(10、20、30和40mmol/L glucose,HG),分别培养24h,MTT技术检测细胞活力;DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平;用10与30 mmol/L的葡萄糖分别培养足细胞24h,通过Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot技术检测cleaved-caspase-3,cleaved-PARP和Bcl-2凋亡相关蛋白表达情况。(2)利用前期足细胞损伤模型,采集一定量足细胞,将其随机分为6组:正常对照组、高糖组、THHta高剂量组细胞对照组、高糖+THHta不同剂量干预组(1.25 μg/mL、2.5μg/mL和5 μg/mL),分别培养24h,MTT技术检测细胞活力;DCFH-DA试剂盒检测ROS水平检测;流式细胞术检测凋亡水平;Western blot技术检测cleaved-caspase-3,cleaved-PARP和Bcl-2凋亡相关蛋白表达情况;ELISA法检测细胞中细胞因子TNF-α与IL-6的表达水平。(3)同样利用前期细胞模型,5 μg/mL THHta干预24 h后,采用microRNA芯片技术筛选一系列与足细胞损伤相关的microRNAs的表达情况,并对差异表达最大的miR-29a通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证。体外培养条件永生性小鼠足细胞,随机分为七组:正常对照组、高糖组(HG)、高糖+THHta、高糖+THHta+inhibitor negative control(NC)组、高糖+THHta+miR-29a inhibitor 组,高糖+THHta+mimics negative control(NC)组、高糖+THHta+miR-29amimics组。MTT技术检测细胞活力;DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平;通过AnnexinV-FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。利用生物信息学方法分析miR-29a的潜在靶点并结合荧光素酶实验进行验证。miR-29a inhibitor与miR-29a mimics转染小鼠足细胞后培养24 h,采用qRT-PCR检测PTEN mRNA水平,Western blot技术检测PTEN蛋白的表达水平。(4)因THHta能够上调miR-29a的表达,miR-29a可以靶向抑制PTEN的表达,因此,我们推测THHta通过上调miR-29a的表达,进而下调PTEN的表达,最终增强对高糖诱导的足细胞损伤的保护作用。为了验证我们的假设,我们分别将miR-29amimics与编码PTEN融合蛋白的质粒pcDNA-PTEN共转染进足细胞,并在转染后48 h先后给予THHta与高糖处理继续培养48 h,采用MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及应用DCFH-DA探针法检测细胞内ROS生成水平。研究结果:(1)研究发现在不同糖浓度培养的足细胞中,足细胞活力呈梯度下降,以正常糖组(5.5mM)为对照,各组之间差异显著有统计学意义(p<0.05)。结果表明高糖可以使足细胞存活率显著降低,且损伤程度呈浓度依赖效应,浓度越高,损伤越严重。随着刺激糖浓度的增加,足细胞内活性氧的生产呈梯度增加,以正常糖组(5.5mM)为对照,各组之间差异显著有统计学意义(p<0.05)。该结果与之前报道的结果一致,结果表明高糖可以使足细胞内活性氧生成增加,且呈浓度依赖效应。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:随着刺激糖浓度的增加,足细胞凋亡增加,且呈浓度依赖。Western Blot结果显示了促凋亡因子cleaved-caspase-3与cleaved-PARP的表达也是随葡萄糖浓度的增加而显著提高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下调。综上所述,我们成功的建立了高糖诱导的足细胞损伤模型,为下一步的实验研究奠定了物质基础。(2)MTT法检测结果显示,与对照组相比,HG组细胞增殖活力明显减弱(p<0.01)。与HG组相比,HG+THHta各剂量组细胞活力呈依次上升趋势,其中,HG+THHta5μg/mL组细胞活力增加最为明显(p<0.01)。结果表明随着THHta药物浓度的升高,其缓解高糖对足细胞活力抑制作用的能力逐渐增强,在本实验剂量(1.25、2.5、5μg/mL)内,THHta缓解高糖对细胞活力抑制作用的能力具有一定的浓度依赖性,同时也证明THHta在此浓度内对小鼠足细胞无毒副作用。DCFH-DA荧光探针法结果显示,与对照组相比,HG组足细胞细胞内ROS水平明显增加(p<0.01)。与HG组相比,HG+THHta各剂量组细胞内ROS水平呈依次降低趋势,其中,HG+THHta 5 μg/mL组细胞内ROS水平下降最为明显(p<0.01)。结果表明随着THHta药物浓度的升高,其对高糖诱导的细胞内ROS水平的抑制作用逐渐增强,在本实验剂量(1.25、2.5、5μg/mL)内,THHta对高糖诱导的细胞内ROS水平的抑制作用和浓度密切相关。而流式细胞术法检测发现,与对照组相比,HG组的细胞凋亡明显增加(p<0.01)。与HG组相比,HG+THHta各剂量组细胞凋亡呈依次下降趋势,其中,HG+THHta5 μg/mL组细胞凋亡下降最为明显(p<0.01)。结果表明随着THHta药物浓度的升高,其对高糖诱导的足细胞凋亡的抑制作用逐渐增强,在本实验剂量(1.25、2.5、5 μg/mL)内,THHta对高糖诱导的细胞凋亡的抑制作用具有一定的浓度依赖性。ELISA检测细胞上清中TNF-α与IL-1β结果表明,与对照组相比,HG组TNF-α与IL-1β3的表达明显增加(p<0.01),表明足细胞内部发生的炎症反应也可导致足细胞损伤。与HG组相比,HG+THHta各剂量组TNF-α与IL-1β3的表达呈依次下降趋势,其中,HG+THHta 5 μg/mL组的TNF-α与IL-1β表达下降最为明显(p<0.01)。结果表明随着THHta药物浓度的升高,其对高糖诱导的TNF-α与IL-1β的表达的抑制作用逐渐增强,在本实验剂量(1.25、2.5、5 μg/mL)内,THHta对高糖诱导的细胞凋亡的抑制作用具有一定的浓度依赖性,提示我们THHta通过抑制炎症反应减轻足细胞损伤。(3)在足细胞损伤模型中,THHta干预组与高糖组相比,19个miRNAs发生了显著上调,同时21个miRNAs发生了显著下调。他们与炎症,凋亡等过程密切相关。其中,miR-29a在高糖足细胞损伤模型中下降最显著,且在干预组恢复效果最好,而PCR功能检测发现其在高糖刺激下表达下调,而在THHta干预后miR-29a表达上调,且呈浓度依赖性。接下来,我们利用功能性获得或缺失的方法研究miR-29a的生物学功能。结果发现miR-29a inhibitor能够抑制THHta对足细胞的保护效果,且下调miR-29a的表达可以有效抑制THHta诱导的细胞增殖,促进细胞凋亡,而miR-29a mimics却能增强THHta的效果,且上调其表达可以有效抑制高糖诱导的足细胞凋亡并促进细胞活力的增加。利用生物信息学分析结合荧光素酶报告实验发现PTEN序列中存在与miR-29a序列保守结合的位点。结合荧光素酶试验,qRT-PCR与Western blot的结果,表明PTEN是miR-29a的一个靶基因。进一步的研究结果表明miR-29a mimics增强THHta对足细胞的保护效果,过表达PTEN能够抑制THHta的效果,暗示我们miR-29a可能是通过靶向PTEN的负向调节来增强THHta效果的。结论:THHta可能通过上调miR-29a的表达抑制PTEN的表达,继而抑制细胞凋亡,促进细胞活力增加,最终缓解足细胞损伤。该结果为糖尿病肾病的治疗提供了新的靶点和一定参考作用。