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草鱼是我国重要的淡水养殖品种,其产量占淡水养殖总产量20%。草鱼出血病是草鱼鱼种阶段最为严重的疾病,该病发病季节长,流行范围广,死亡率高,其病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)。草鱼呼肠孤病毒已被证实是致病力最强的水生呼肠孤病毒,到目前为止,已报道的草鱼呼肠孤分离株有20多株。根据目前已有研究,草鱼呼肠孤病毒主要有三种基因型,不同基因型的毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性均小于30%,而同一基因型的毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性均大于95%。不同分离株在基因组带型、基因组序列、对草鱼的致病能力、致细胞病变能力等方面有一定的差异。草鱼呼肠孤病毒存在不同的基因型也给草鱼出血病的防治带来了困难。目前,草鱼出血病的预防和治疗主要依赖疫苗免疫预防与天然植物药物治疗等方法,但效果有限。分离鉴定草鱼呼肠孤病毒流行毒株,探索新的草鱼出血病预防与控制技术具有较大的科学意义与应用价值。本研究针对草鱼出血病开展了草鱼呼肠孤病毒流行株的分离鉴定和运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术抑制草鱼呼肠孤病毒的复制相关研究,主要结果如下：1.草鱼呼肠孤病毒流行毒株的分离鉴定：从湖北患典型草鱼出血病的草鱼体内分离到一株新致病型草鱼呼肠孤病毒,暂命名为GCRV-104。采用细胞培养分离的技术,分离并纯化病毒,经人工感染试验、电镜超微观察、病毒的理化特性分析及病毒的基因组分析,确认该分离株属于草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型。用该病毒进行人工感染健康草鱼,可复制出自然发病类似症状；病毒感染草鱼肾脏细胞系(CIK)可以产生典型的细胞病变。病毒感染细胞的超薄切片电镜观察结果显示,病毒在细胞质内复制,呈晶格状排列,双层衣壳,无囊膜,直径约60-70nnm；冻融、氯仿、乙醚、56℃1h处理对病毒滴度影响不显著,65℃1h处理病毒滴度下降显著。病毒基因组SDS-PAGE分析和核酸敏感性试验结果表明,其基因组由11个分段的RNA核酸节段组成,为典型的水生呼肠孤病毒基因组结构。病毒基因组S8节段全长基因的克隆测序分析其全长核苷酸数目为1319bp编码VP6蛋白,与Genbank中登录的草鱼呼肠孤病毒分离株GCRV-873, GCRV-991, GCRV-875, GCRV-876的氨基酸序列的同源性仅为22.6%。该流行毒株的分离鉴定为研究草鱼出血病的流行病学、诊断方法与防治技术提供了重要的病原材料。2.真核表达载体介导的siRNA抑制草鱼呼肠孤病毒的复制：针对草鱼出血病呼肠孤病毒(GCRV-JX09-01)分节段基因组L2片段上的RNA聚合酶基因(RdRp)和S10片段上的外衣壳蛋白基因(OCP),设计并合成可转录为siRNA结构的DNA分子,利用在合成的DNA分子上引入的限制性酶切位点,将合成的DNA分子克隆到pSilencer真核表达载体中,构建含有siRNA结构的转录载体pSi-1286, pSi-117,经PCR鉴定及测序分析确认重组载体的正确性。采用脂质体转染法用重组载体转染草鱼肾脏组织细胞(CIK),并用感染复数(MOI)为0.01的GCRV感染CIK细胞,分别通过细胞病变效应(CPE)、real-time RT-PCR、病毒滴度测定来评定载体转录siRNA对GCRV在CIK细胞中复制的影响情况。结果显示,所构建的siRNA载体转录产生siRNA可以有效抑制CIK中GCRV的复制,病毒滴度下降,干扰组GCRV mRNA的水平仅为病毒阳性对照组的11.22%和26.86%,而阴性对照组没有明显的抑制效果。该结果说明真核表达载体介导的siRNA可以作为抑制GCRV感染和复制的新途径。3.siRNA多表达载体抑制不同基因型GCRV分离株的复制：为了实现RNA干扰可以同时抑制不同基因型草鱼呼肠孤分离株的复制,本研究设计并构建了同时靶向流行株GCRV-JX09-01(GCRV I型)及GCRV-104(GCRV III型)的siRNA多表达载体,pMultisiVP2/2(靶向GCRV-JX09-01和GCRV-104的VP2蛋白基因)；pMultisiVP6/7(靶向GCRV-JX09-01VP7蛋白基因和GCRV-104VP6蛋白基因)。两个siRNA多表达载体均可同时抑制GCRV-JX09-01和GCRV-104在CIK细胞上的复制,并且无明显的细胞毒性。转染pMultisiVP2/2组,GCRV-JX09-01. GCRV-104VP2mRNA拷贝数分别下降为10.98±2.5%,10.16±3.1%；转染pMultisiVP6/7组GCRV-JX09-01VP7、GCRV-104VP6mRNA拷贝数分别下降为19.37±3.7%,13.22±2.75%,显著低于阳性对照组mRNA转录水平,而转染pSiNC组与病毒阳性对照组没有显著差别。本研究首次将siRNA多表达载体应用于抑制水生病毒的研究中。该实验方法的建立和应用,将为使用RNAi抑制不同基因型GCRV分离株奠定理论基础和材料基础,为防治草鱼出血病提供了潜在的新途径。