【摘 要】
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本论文合成了三种2,9,10-三甲氧基-7-氧化阿朴菲生物碱衍生物,并以它们为配体,与9种具有潜在生物活性的锌、镍、铜、钌、镧、钐、铈、钕、钋反应制备得到12种新型配合物,利用电喷雾质谱,核磁共振波谱,红外光谱以及X-射线单晶衍射分析等手段对这些配合物进行结构表征。在细胞水平上,利用MTT法测试了配体与配合物的体外抗肿瘤活性,通过流式细胞仪检测法、细胞形态学法、蛋白质印迹法Western Blot
【基金项目】
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国家自然科学基金； 广西自然科学基金；
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本论文合成了三种2,9,10-三甲氧基-7-氧化阿朴菲生物碱衍生物,并以它们为配体,与9种具有潜在生物活性的锌、镍、铜、钌、镧、钐、铈、钕、钋反应制备得到12种新型配合物,利用电喷雾质谱,核磁共振波谱,红外光谱以及X-射线单晶衍射分析等手段对这些配合物进行结构表征。在细胞水平上,利用MTT法测试了配体与配合物的体外抗肿瘤活性,通过流式细胞仪检测法、细胞形态学法、蛋白质印迹法Western Blot等技术手段,基于诱导凋亡和周期阻滞机理对配体与配合物的抗肿瘤作用机制进行了研究,为深入研究此类基于天然活性配体的金属抗肿瘤药物提供了重要的基础。具体研究内容如下:一、为了探讨氧化阿朴菲生物碱骨架上的1号位R基团对配体及其金属配合物抗肿瘤活性的影响,本论文通过全合成方法得到三种具有构效关系的2,9,10-三甲氧基-7-氧化阿朴菲生物碱衍生物,即1号位上的R基团分别为氢原子（R=H）,给电子基团甲氧基（R=OCH3）,吸电子基团三氟乙氧基（R=OCH2CF3）,以它们为配体分别合成了3种未见报道的锌配合物（配合物1、2、3）。以1-三氟乙氧基-2,9,10-三甲氧基-7-氧化阿朴菲为活性配体,分别与镍、铜、钌、镧、钐、铈、钕、钋反应制备得到9种新型配合物（配合物4、5、6、7、8、9、10、11、12）。利用电喷雾质谱,核磁共振波谱以及单晶X-射线衍射分析等手段对这些配合物进行结构表征:[Zn（OG1）2（DMSO）2]（ClO4）2（1）[Ru（OG3）Cl2（DMSO）2]（7）[Zn（OG2）2（H2O）2]（ClO4）2（2）[La（OG3）3（NO3）3]（8）[Zn（OG3）2（ClO4）2]（3）[Sm（OG3）（1,10-Phen）（NO3）3]（9）[Ni（OG3）2（NO3）2]（4）[Ce（OG3）3（NO3）3]（10）[Cu（OG3）2（NO3）2]（5）[Pr（OG3）3（NO3）3]（11）[Zn（OG3）2（NO3）2]（6）[Nd（OG3）2（NO3）3（H2O）]（12）二、通过MTT法初步检测配体及其12种金属配合物对5种肿瘤细胞株（MGC80-3、T-24、Hep-G2、SK-OV-3、He La）与人正常肝细胞株HL-7702的增殖抑制作用,选取对配合物敏感的肿瘤细胞株进行测定其IC50值,结果显示配合物1～6对T-24与MGC80-3肿瘤细胞的活性最好,其IC50值均在10μM以内。三、利用流式细胞术法检测配合物1～6诱导T-24和MGC80-3肿瘤细胞的细胞周期阻滞情况,实验结果表明配合物1、3、4、5、6能将细胞增殖阻滞在G2,配合物2能将细胞增殖阻滞于S期。Western Blot实验发现配合物1、3、4、5、6作用T-24肿瘤细胞后,G2期相关的蛋白p21、p27、p53蛋白的表达量升高,CDC25C、CyclinA2、CyclinB1、CDK1蛋白的表达量下降,由此可知,配合物1、3、4、5、6是通过改变这些蛋白水平的表达将癌细胞阻滞于G2期,从而诱导细胞凋亡。配合物2作用T-24肿瘤细胞后,S期相关的蛋白p21、p27、p53蛋白的表达量升高,CDC25A、CyclinA2、CyclinE1、CDK2蛋白的表达量升高,表明配合物2将细胞阻滞于S期。利用ICP-MS检测配合物1～6中的金属离子在人膀胱癌细胞T-24各细胞器中的分布情况,由实验结果可知,在作用人膀胱癌T-24细胞后,配合物1中的Zn主要分布在肿瘤细胞中的线粒体和细胞核组分;配合物2中的Zn主要分布在细胞膜组分;配合物3中的Zn主要分布在细胞核组分;配合物4中的Ni主要分布在线粒体组分;配合物5中的Cu主要分布在细胞浆和线粒体组分;配合物6中的Zn主要分布在细胞膜中。结果表明了6种配合物可能是具有不同的作用机制,发挥的药物活性效应不一样。四、运用流式细胞术检测法、Western Blot及细胞形态学法等检测手段探究了配合物1～6诱导人膀胱癌细胞T-24的凋亡作用机制。通过流式细胞仪检测,凋亡实验结果表明配合物1～6均能显著诱导细胞发生凋亡;JC-1实验结果表明配合物1～6作用T-24细胞后线粒体膜电位下降;通过流式细胞术与细胞形态学方法检测到配合物1～6作用T-24后,细胞内的ROS与Ca2+水平明显升高;通过流式细胞仪检测,配合物1～6作用T-24细胞后,细胞内的caspase-3、caspase-9被激活;通过Western Blot实验检测,配合物1～6作用T-24细胞后,细胞内的抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达量下调,促凋亡蛋白Bak、Bax表达量上调,Cytochrome c的蛋白表达量也随之增加,结果表明配合物1～6可能是通过使线粒体功能紊乱从而诱导人膀胱癌细胞发生凋亡。
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